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Mar 19, 2023

運動活動と交感神経性心血管反応を駆動する脳幹単シナプス興奮性経路

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 13、記事番号: 5079 (2022) この記事を引用

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運動を含む運動には、収縮する筋肉の代謝要求を満たすために適切な自律心血管調整が必要ですが、これらの調整の基礎となる機能的な脳の構造は依然として不明です。 今回我々は、運動活動と交感神経性心血管反応を促進するために、意志運動信号、つまり中枢指令を中継する上で重要な役割を果たす脳幹回路を実証する。 ラットの中脳運動ニューロンは、少なくとも部分的にグルタミン酸作動性プロセスを介して中枢指令駆動の興奮性シグナルを吻側延髄腹側外側に伝達し、体性運動神経系と交感神経系の両方を活性化します。 この単シナプス経路の光遺伝学的興奮は、ランニング運動中に見られるような運動反応および心血管反応を誘発しますが、経路阻害は、基礎心血管恒常性に影響を与えることなく、随意ランニング中の運動活動と血圧上昇を抑制します。 これらの結果は、中枢指令信号を伝達する重要な皮質下経路を実証し、運動パフォーマンスを最大化するために不可欠な生理学的コンディショニングに必要な中枢回路機構についての重要な洞察を提供する。

人間を含む脊椎動物の基本的な行動の一部である移動を含む運動には、骨格筋の収縮によって要求される燃料や酸素などの代謝リソースを提供する自律的な心血管調整が伴い、それによって身体パフォーマンスが向上します。 前脳からのフィードフォワード下行運動信号が心血管制御に寄与していることは、1 世紀以上にわたって示唆されてきました 1,2。 現在、このフィードフォワード信号は中枢指令と呼ばれ、脳内の体性運動系と自律運動系を並行して活性化し、動脈圧と心臓の収縮性とともに筋活動を同時に増加させると考えられています3。 この概念は、一定の筋張力での自発的な等尺性運動中の心血管反応の大きさが、主動筋または拮抗筋のいずれかの腱の振動による反射性収縮によって変化する中枢指令活性化の量と正の相関があることを示す人体研究から初めて生まれました4。 中枢指令は、運動フィードバックとは無関係に交感神経系の活性化と結びついている。これは、皮質麻痺の猫における架空の移動中の心血管変数の増加や、麻痺後のヒト被験者の随意筋収縮に対する心臓血管反応の誇張によって示されている6、7。

運動中に中央指令信号が自律心血管調整を引き起こす中枢回路機構がまだ完全に解明されていないため、中枢指令源の正確な位置は不明のままである。 自発的な運動に反応して活性化される自律神経の脳領域 8、9、10、11、12、または刺激によって自律神経反応または体性運動反応が誘発される領域 13、14、15、16、17、18 は、循環の中枢指令制御に関与している可能性があります。 例えば、神経外科技術を用いた人体研究では、視床下核（STN）や中脳水道周囲灰白質（PAG）を含む中脳回路は、自発的な運動中に神経活動が亢進し11、脳の昇圧作用によって証明されるように、中枢指令信号を中継する皮質下回路を構成していることが示唆されている19。パーキンソン病または慢性疼痛を患い、覚醒している患者における STN17 または背側/側方 PAG18 の電気刺激。 それにもかかわらず、運動中の自律神経の変化におけるこれらの脳領域の因果関係や、他の領域との機能的つながりは実証されていません。 中枢指令を司る脳基質も臨床的に重要性を増しています。 心不全などの病的状態での運動中の心血管調節の異常は、運動不耐症や不整脈などの致命的な心臓イベントのリスクを高めます20。 これは少なくとも部分的には中枢指令の機能不全によって引き起こされます 21,22 が、患者に対する治療的運動プログラムは機能状態と転帰を改善します 23。

顔面核の尾極のすぐ尾側に位置する吻側延髄腹外側部（RVLM）には、脊髄に突き出た交感神経運動前ニューロンが含まれており、その半分以上がアドレナリン作動性 C1 ニューロンです24。 RVLM C1 ニューロンと非 C1 ニューロンは両方とも自発的な運動によって興奮し 8,9,12、交感神経の血管運動神経の調節に重要な役割を果たします 25,26,27,28。 したがって、RVLM は運動中の交感神経心血管反応の中枢回路機構の重要なノードである可能性があります 29。 本研究では、随意運動中に中枢指令信号をRVLMに伝達して心血管反応を引き出す皮質下単シナプス経路を特定するために、機能神経解剖学とラットの生体内生理学的実験を行い、末梢神経放電、心血管の変化、およびラットの行動を記録した。光遺伝学的技術と組み合わせて、目的の経路を操作します。

まず、RVLMに片側から注入されたトレーサーであるコレラ毒素bサブユニット（CTb）を用いた逆行性追跡により、ラットのRVLM投影ニューロンを探しました（図1a、b）。 かなりの数のCTb標識神経細胞体が、楔状核（CnF）および脚橋被蓋核（PPTg）を含む中脳領域に両側に分布していることが判明し、後者には多くのコリン作動性ニューロンが存在しました（図1c）。 これら 2 つの核は、中脳運動領域 (MLR) として知られる機能領域を構成し、運動を開始および制御することができ、ヒトを含む哺乳類種全体で進化的によく保存されています 30,31。 そこで、運動運動に関与する中枢指令信号伝達を媒介する皮質下経路の候補として、この単シナプスMLR→RVLM経路に注目した。 MLR には、コリン作動性 PPTg ニューロンに加えて、グルタミン酸作動性ニューロンと GABA 作動性ニューロンが含まれており、髄質網様体全体にわたって両側に多数の投射を送ります 32。 ただし、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）に対して免疫反応性を示したCTb標識PPTgニューロンはほとんどありませんでした（0.6±0.3％、n = 3）（図1d）。 したがって、RVLM 投影 MLR ニューロンは主に非コリン作動性です。

a、b RVLM への一方的な CTb 注入。 TH チロシンヒドロキシラーゼ; IO下オリーブ核。 LPGi 側傍巨細胞核。 NA 濁核。 スケールバー: 1 mm。 c CTb標識細胞[ラット8匹(雄6匹、雌2匹)から結合]およびCTb陽性または陰性ChAT免疫反応性細胞[ラット8匹中3匹(雄2匹、雌1匹)から結合]の分布の図。中脳の冠状部分。 アクア水道橋。 PAG水道周囲灰色。 d CTb標識PPTg細胞がChAT免疫反応性細胞と融合していないことを示す共焦点画像。 スケールバー: 50 μm。 e、f MLR への AAV-CMV-ChIEF-tdTomato の両側注入。 スケールバー: 1 mm (中脳) および 200 μm (拡大)。 g tdTomato 標識軸索は腹側延髄に分布しています。 スケールバー: 1 mm。 h VGLUT2 を含む tdTomato 標識軸索腫脹 (矢印) と RVLM C1 ニューロン樹状突起および細胞体 (アスタリスク) との密接な関連を示す共焦点画像。 スケールバー: 10 μm。 トレッドミル運動したラットと運動していないラットのRVLM投影MLRニューロンにおけるFos免疫反応性を研究するための実験スキーム。 j GFP および Fos の免疫蛍光染色。 矢印は、PPTg に見られる GFP 標識細胞における Fos 発現を示します。 スケールバー: 100 μm。 k GFP標識RVLM投影MLRニューロンにおけるFos免疫反応性細胞の、運動していない対照と運動したラットとの間の比較（異なる群ごとにn = 7、すべて雄）。 データは両側ウェルチ t 検定によって分析されました。 t 統計値および自由度を含む統計情報を補足表 15 に示します。示されているデータは平均値 ± SEM です。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 図（a、e、i）で使用されている脳切片画像は、「Paxinos G & Watson C. The Rat Brain instereotaxic Coords. 6th edn. (Amsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)」から改変されました。

MLR→RVLM経路を順行的に追跡するために、tdTomatoと融合したチャネルロドプシン変異体であるChIEFをコードするアデノ随伴ウイルスベクター（AAV）をCnFとPPTgにわたる領域に両側注入しました（図1e、f）。 ChIEF-tdTomato標識されたMLR由来の軸索は、髄質の腹側部分に豊富に分布していました（図1g）。 さらに、小胞性グルタミン酸トランスポーター2（VGLUT2）を含むMLR由来の軸索の腫れは、RVLM C1ニューロンの細胞体および樹状突起と密接に関連しており（図1h）、グルタミン酸作動性MLR→RVLMニューロンとRVLM C1ニューロンの間にシナプス接触が存在することを示唆しています。 。 全体として、これらの観察は、RVLM が MLR から単シナプス性グルタミン酸作動性両側投射を受け取ることを示しています。

次に、MLR→RVLM経路がランニング運動によって活性化されるかどうかを調べました。 我々は、EGFPをコードする逆行性AAV（AAVrg）の両側RVLM注射を受けたラットの自発的走行後のMLR→RVLM投射ニューロンにおける発火増加の生化学的相関関係であるFosの発現を調査した。 これらのラットは、自発的なトレッドミル運動に慣れるように訓練されていました（図1i）。 CTbを注射したラットからの観察と一致して、RVLM投影ニューロンのAAVrg形質導入により、CnFとPPTg全体のMLR内のEGFP標識された非コリン作動性細胞体の密な局在が生じました（補足図1a、b）。 トレッドミルでの自発的ランニング（16 m/分で40分間）は、非運動対照と比較して、EGFP標識（すなわち、RVLM投影）MLRニューロンにおけるFos発現を増加させた（図1j、k）。 これらの結果は、自発的なランニング運動が MLR → RVLM 経路を活性化することを示しており、この単シナプス経路がランニング運動に関与する自発的な中枢指令信号伝達を媒介する中枢回路機構の一部であるという概念と一致します。

トレッドミル運動後の Fos 発現の増加は、ChAT 免疫反応性 PPTg ニューロンでも観察されました（補足図 1c、d）。 興奮したコリン作動性 PPTg ニューロンは、ランニング運動中の移動運動を促進する役割を果たす可能性がありますが、誘発することはありません 33。

自律心血管調節における MLR → RVLM ニューロンの役割を研究するために、動脈圧 (AP) と心拍数 (HR) に対する MLR → RVLM ニューロンの光遺伝学的刺激の影響を調べました。 MLR への AAV 注射を介して MLR ニューロンが ChIEF-tdTomato または palGFP (コントロール) を発現したウレタン麻酔ラット (図 1e-h) では、5 ミリ秒のパルス青色レーザー光 (473) を使用して RVLM を両側から照射しました。 nmの波長）を10 mWの出力（継続的に活性化した場合）で、脳に挿入された光ファイバーを通じてMLR→RVLMニューロン軸索を光刺激します（補足図2a）。 20または40 Hzの2分間のパルスシリーズは、ChIEF-tdTomato発現ラットで昇圧反応と頻脈反応を一貫して誘発しましたが、palGFP発現コントロールでは誘発しませんでした（補足図2b、c）。 これらの観察は、興奮したMLR→RVLMニューロンが自律心血管反応を誘発することを示しており、このことが腎交感神経活動（RSNA）の電気生理学的記録を用いてMLR→RVLM単シナプス経路の交感興奮性の役割を直接調べるきっかけとなった。

RVLMへのAAVrgの両側注射により、RVLM投影ニューロンがGFPまたは対照EGFPでタグ付けされたチャネルロドプシン-2（ChR2）を発現した麻酔ラット（補足図1a、b）では、MLRは細胞体を光刺激するために両側から照射されました。 MLR → RVLM ニューロンの / 樹状突起 (体細胞ターゲティング) を断続的に、つまり 0.5 秒の一連のパルス (10、20、または 40 Hz、10 mW のレーザー出力で 5 ミリ秒のパルス青色レーザー光) を介して、 1分間に1.5秒の間隔。 次に、RSNAに対するこの手順の影響を調べました（図2a）。 光刺激は、0.5秒の照明パルスの各発作と同期して腎交感神経興奮（RSNA）を誘発し、1分間の刺激期間を通じてAPの増加を伴いましたが、HRの増加は伴いませんでした（図2b）。 30回の介入にわたるRSNAの変化を重ね合わせて平均した分析（図2c）は、40 Hzではなく10または20 Hzの一連のパルスが腎臓の交感神経興奮を有意に誘発し、その後急速な交感神経抑制が起こり、光刺激前のレベルに戻ることを示した。 (図2d)。 RSNAの変化の曲線下面積（AUC）によって評価した40 Hzでの光刺激に応答した交感神経興奮性成分（図2c）は、20 Hzの場合よりも29％小さかった（P = 0.034、両側）対応のある t 検定）、おそらく麻酔の影響によるものと考えられます。これは、麻酔をかけずに除脳したラットに 40 Hz で光刺激を与えると、RSNA が 20 Hz の場合と比べて有意に増加したためです（後述；図 3）。 ウレタン麻酔は、交感神経調節回路内の高周波光刺激によって引き起こされる再発抑制の効果を増幅させる可能性があります。 MLR→RVLMニューロンの光遺伝学的刺激によって誘発される交感興奮性/交感神経抑制反応の特異性を示し、対照ラットにおけるEGFP発現、RVLM投影MLRニューロンの照射によってRSNA変化は誘発されませんでした（補足図3a）。

a 麻酔をかけたラットにおけるMLR→RVLMニューロンの光遺伝学的刺激。 矢印: 光ファイバーの先端の位置。 b ChR2-GFP発現麻酔ラットにおける光遺伝学的刺激（20Hz）中の代表的な記録。 水色の背景はイルミネーション期間を示します。 c パネル b に示す RSNA に対して実行された重ね合わせおよび平均化分析。 各サイクル（上）中のベースライン（=最初の光遺伝学的介入前の30秒の平均値）からのRSNAのパーセンテージ変化の時間経過（10ミリ秒ビン）を、30回の介入にわたる各時点で平均しました（下）。 d ChR2-GFP発現麻酔ラットにおける断続的なMLR→RVLMニューロン刺激に応答した、重ね合わせて平均した分析後のΔRSNAの時間経過（100ミリ秒ビン）[n = 9（雄7、雌2）、n = 10 Hz で 7 名 (男性 5 名、女性 2 名)]。 e ChR2-GFP発現麻酔雄ラット（n = 6）におけるMLR→RVLMニューロン刺激（20Hz）に対するRSNA応答に対するRVLMのグルタミン酸受容体遮断の効果。 矢印: RVLM 注入用のピペット チップの位置。 データは、ランク別のフリードマン一元配置RM ANOVA（正規性または等分散検定に合格しなかったため）、続いてダネットの事後検定（d）または両側対応のあるt検定（e）によって分析されました。 F/t/χ2 統計値および自由度を含む統計情報を補足表 15 に示します。 * P < 0.05 対 30 秒の平均ベースライン。 #P < 0.05 対 30 回の介入にわたる各光刺激直前の 1 秒平均値。 パネル d および e のベースライン値は、それぞれ補足表 2 および補足表 4 に報告されています。 示されているデータは平均値 ± SEM です。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 図（a、e）で使用されている脳切片画像は、「Paxinos G & Watson C. The Rat Brain instereotaxic Coords. 6th edn. (Amsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)」から改変されました。

a 無麻酔の除脳ラットにおけるMLR→RVLMニューロンの光遺伝学的刺激。 b ChR2-GFP発現脱脳ラットにおける光遺伝学的刺激（40Hz）中の代表的な記録。 c、d ChR2のMLR→RVLMニューロンの1分間の断続的刺激に応答したΔRSNAおよびΔVRNAの重ね合わせおよび平均分析後（c 100ミリ秒ビン）および光遺伝学的介入全体（d 10秒ビン）の時間経過-発現脱脳雄ラット(n = 6)。 e ChR2-GFP発現除脳男性における、MLR→RVLMニューロン（40Hz）の15秒間持続刺激に対するΔVRNAおよびΔAP応答に対するRVLMのグルタミン酸受容体遮断の影響（15秒間のそれらの積分値によって評価）ラット (n = 6)。 データは、ランク別の一元配置RM ANOVA/フリードマン一元配置RM ANOVAとそれに続くダネットの事後検定(c、d)または両側対応のあるt検定(e)によって分析されました。 F/t/χ2 統計値および自由度を含む統計情報を補足表 15 に示します。 * P < 0.05 対 30 秒の平均ベースライン。 #P < 0.05 対 30 回の介入にわたる各光刺激直前の 1 秒平均値。 パネル (c、d) および (e) のベースライン値は、それぞれ補足表 5 および 7 に報告されています。 示されているデータは平均値 ± SEM です。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 図 (a) で使用されている脳切片画像は、「Paxinos G & Watson C. The Rat Brain instereotaxic Coords. 6th edn. (Amsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)」から改変されました。

MLR → RVLM ニューロンは軸索終末で VGLUT2 を発現し（図 1h）、多くの RVLM ニューロンはイオンチャネル型グルタミン酸受容体を発現する 34 ため、RVLM におけるグルタミン酸作動性伝達が MLR → RVLM ニューロンを介した交感神経興奮に寄与するかどうかを調べました。 生理食塩水 (50 nL) または 2-アミノ-5-ホスホ吉草酸の混合物を RVLM に両側から注射した 10 ～ 20 分後に、MLR → RVLM ニューロンの 1 分間の間欠的な光遺伝学的刺激 (20 Hz) に対する RSNA 応答をテストしました。およびシアンキキサリン（AP5/CNQX; 生理食塩水中10 mM; 50 nL）。 生理食塩水治療と比較して、AP5 / CNQX治療は、RSNA変化のAUC値によって評価されるように、光遺伝学的に誘発されたRSNA応答の23％減少をもたらしました（図2e;補足図3b）。 AP5/CNQX 処理の 60 分後、RSNA 応答は生理食塩水処理後の 90% まで回復しました (P = 0.58; 両側対応 t 検定)。 総合すると、これらの結果は、RVLM におけるグルタミン酸作動性伝達が、腎臓の交感神経興奮を引き起こす MLR → RVLM シグナル伝達に寄与していることを示しています。

グルタミン酸作動性 MLR ニューロンが運動の誘発に重要な役割を果たしている 33,35,36,37 ことを考えると、MLR → RVLM ニューロンの興奮が交感神経興奮だけでなく運動ニューロンの興奮、つまり中枢指令の活性化も誘発するかどうかを疑問に思いました。 この可能性を調査するために、我々は、除脳され、無麻酔で、麻痺したラットの末梢交感神経線維と体性運動遠心性神経線維の放電を同時に記録した。 この準備では、皮質視床回路からの抑制の喪失が脳幹の過活動につながるのに対し、麻酔と運動フィードバックの影響を無視できるという利点があります。 RVLM投影ニューロンがChR2-GFPを発現している除脳ラットは、上記のように断続的に1分間MLRにレーザーパルスを片側に受信しました（レーザー出力20 mW、図3a）。 MLR→RVLMニューロンの光遺伝学的刺激は、HRに有意な影響を与えることなくAPを上昇させ、腎臓交感神経線維と体性運動神経線維の両方のL5腹側根38神経線維の放電を増加させました（図3b）。 注目すべきことに、光遺伝学的介入中のこれらの神経線維の放電方法は異なっていた。 腎臓交感神経興奮（RSNA）は、0.5秒の照明パルスの各発作と同期して即座に誘発されましたが、腹根神経活動（VRNA）は徐々に上昇し、1分間の介入を通じて維持されました（図3b〜d）。 VRNA の持続的な増加は、除脳ラット 21 およびネコ 39 における MLR の電気刺激の効果を調べた以前の研究の結果と一致しています。 交感神経と体性運動ニューロンの放電反応の特性におけるこのような違いは、MLR → RVLM ニューロンと脊髄運動ニューロンの間の髄脊髄回路が低域フィルターの役割を果たすのに対し、MLR → RVLM 経路の下流の別個の髄脊髄回路が急速な交感神経の放電反応を媒介することを示唆しています。神経反応。 ChR2を介した交感神経および体性運動流出の活性化とは対照的に、EGFP発現対照における照明はVRNAの変化を誘発しなかった（補足図3c、d）。

除脳ラットを使用して、MLR→RVLMニューロンの刺激によって引き起こされる運動ニューロンの興奮と心血管反応がRVLMのグルタミン酸作動性神経伝達に関与しているかどうかもテストしました。 RVLM への両側 AP5/CNQX 注射は、MLR → RVLM ニューロンの 15 秒間の持続光刺激に応答した VRNA の活性化と AP の上昇を 64 および 34% 有意に減少させました (15 秒の刺激中の VRNA と AP の変化の統合によって評価)期間）、それぞれ生理食塩水注射後のものと比較しました（図3e、補足図3e）。 VRNA および AP 応答は、AP5/CNQX 処理の 60 分後に、生理食塩水処理後の応答の 105 および 81% まで回復しました (P = 0.62 および 0.16; 両側対応 t 検定; n = 3)。 対照的に、光遺伝学的刺激はHRに影響を与えませんでした（補足図3e）。 全体として、興奮したMLR→RVLMニューロンは、部分的にRVLMにおけるグルタミン酸作動性伝達を介して、交感神経血管収縮物質と体性運動神経の緊張を同時に増加させます。

MLR→RVLM経路による交感神経系と体運動神経系の活性化により、この経路の刺激が運動活動とランニング運動で見られるような自律心血管系の変化の両方を誘発するかどうかを調査することができました。 RVLMへの両側AAVrg注射により、RVLM投影ニューロンがChR2-GFPまたは対照EGFPを発現したラットに、光ファイバーを介してMLR照明を受け、自由移動条件下で圧力テレメーターを使用してAPをモニタリングした。 意識のあるラットを円形トラック（ID100 & OD140 cm）に配置し、ラットが休んでいるが睡眠や運動（毛づくろいなど）をしていないときに、AP、HR、および行動の連続記録下でMLR→RVLMニューロンの細胞体を照射しました。 (図4a～c)。

a 意識のあるラットのMLR→RVLMニューロンの光遺伝学的刺激は、円形トラック上を自由に移動できるようにしておきます。 b ChR2-GFP発現ラットの髄質の軸索線維におけるGFP形質導入（自己蛍光）。 スケールバー: 1 mm。 c 中脳の GFP および ChAT 免疫反応性細胞。 アスタリスク: 埋め込まれた光ファイバー先端の位置。 スケールバー: 1 mm。 d ChR2-GFP発現意識のあるラットにおける15秒間の持続的な光遺伝学的介入（40 Hz; 20 mW）中の代表的な記録。 e 時間経過（3秒ビン）は、15秒間の持続的な光遺伝学的刺激に応答して変化します（n = 8、両側刺激の場合はn = 7、すべて男性）。 各ラットの追跡を補足図4aに示します。 f ChR2-GFP発現意識のあるラットにおける5回繰り返した断続的（5秒レーザーオン/5秒レーザーオフ）光遺伝学的介入（40Hz;20mW）中の代表的な記録。 矢印: テレメトリ信号の切断。 光遺伝学的介入後に切断が発生したため、この記録は結果に含まれました。 g 時間経過（5 秒ビン）は、5 回繰り返される光遺伝学的刺激中に変化します（n = 8、両側刺激の場合は n = 7）。 各ラットの追跡を補足図4cに示します。 データは、一元配置RM ANOVA/フリードマン一元配置RM ANOVAをランク別に使用し、続いてダネットの事後検定を使用して分析されました[e、g]。 F/t/χ2 統計値および自由度を含む統計情報を補足表 15 に示します。 * P < 0.05 対 15 秒の平均ベースライン。 パネル (d) と (f) に示されている録画中の俯瞰ビューは、それぞれ補足ムービー 1 と 2 で報告されています。 パネル (e) および (g) のベースライン値は、それぞれ補足表 8 および 9 に報告されています。 示されているデータは平均値 ± SEM です。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 図 (a) で使用されている脳切片画像は、「Paxinos G & Watson C. The Rat Brain instereotaxic Coords. 6th edn. (Amsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)」から改変されました。

ChR2-GFPを発現するMLR→RVLMニューロン細胞体に40Hzのパルス青色レーザー光（レーザー出力20mW）を15秒間照射すると、APは直ちに増加し、遅れて頻脈が誘発された。 刺激期間全体を通じて、光刺激は、ブレーキや方向転換の能力を妨げることなく、全身の移動や走行も誘発しました（図4d、e;補足図4a;補足映画1）。 さらに、40 Hz (20 mW) で 5 秒間のレーザーオンと 5 秒間のレーザーオフを 1 サイクルとする片側光遺伝学的介入を 5 回繰り返した場合も、昇圧反応とそれに続く頻脈および運動反応を誘発しました。 5 秒の照明パルスの各発作と同期します (図 4f、g; 補足図 4c; 補足ムービー 2)。 これらの光刺激中のラットの歩行/走行距離と心臓血管反応（刺激期間中の積分によって評価）は、10、20、および40 Hz（20 mWで）の周波数に依存し、強度は10、20、および35〜40の範囲に依存しました。 mW (40 Hz) (補足図 4b、d)。 両側の光遺伝学的刺激は、片側の刺激によって引き起こされる反応と同様に、運動反応および心血管反応を誘発しました（図4e、g）。 ただし、EGFP発現コントロールにおけるMLR照明は、運動や心臓血管の変化を引き起こしませんでした（補足図5）。 これらの結果は、興奮したMLR→RVLMニューロンが運動反応と心血管反応の両方を駆動することを示しており、これはMLR→RVLM経路を介して伝達される中枢指令信号が運動肢の動きとランニング運動に必要な自律心血管制御の調整に役割を果たしているという概念を裏付けるものである。

MLR→RVLM神経細胞体の光遺伝学的刺激は、麻酔をかけたラットまたは除脳したラットにおいて頻脈を引き起こさなかった(図2、3)。これはおそらく、RVLMが心臓機能ではなく交感神経血管運動活性を主に制御しているためである25、26、27、28。 一方、意識のあるラットにおけるこの刺激はHRを増加させました（図4）。 頻脈反応は運動反応に続発する可能性があります。 意識のあるラットの動きや四肢の筋肉の収縮による骨格筋に基づく反射（運動昇圧反射）の活性化は、HR 反応に関与しているはずです 40。 また、MLR → RVLM 経路の刺激により、その後他の中枢回路が活性化され、それが心血管反応を引き起こす可能性もあります。 たとえば、MLR は運動と並行して皮質の状態を調節します 41。

また、RVLM を投影する別の交感神経興奮性経路が運動を媒介するかどうかも調べました。 視床下部の室傍核（PVN）には、RVLM 投射ニューロンが豊富に含まれており、麻酔をかけたラットでの選択的刺激により交感神経興奮が引き起こされます 42。 自由に動き意識のあるラットにおけるPVN→RVLM経路の光遺伝学的刺激はAPを増加させるが、移動運動を誘発しないことを発見した（補足図6）。 したがって、MLR → RVLM 経路とは異なり、交感神経興奮性 PVN → RVLM 経路は移動のための体性運動制御には関与しません。

運動活動のための体性自律運動統合におけるMLR→RVLMニューロンの必要性を調べるために、自発的なランニング運動中のこの経路の阻害が運動活動と心血管反応の両方を弱めるかどうかをテストしました。 MLR → RVLM ニューロンを光遺伝学的に阻害するために、Cre 依存性発現系と順行性および逆行性 AAV を組み合わせて、mCherry またはコントロール eYFP と融合した塩化物伝導性チャネルロドプシン iChloC を MLR → RVLM ニューロンに選択的に形質導入しました。 次に、MLR を青色レーザーパルスで両側から照射しました 43 (図 5a)。 iChloC-mCherryまたはeYFPは、Cre発現MLRニューロンの79±5％で発現されました（n = 10ラット、Cre免疫染色が成功した；図5b）。 iChloC-mCherry / eYFP標識軸索はRVLMに豊富に分布しており、軸索末端はRVLM C1ニューロンに対向しており（図5c）、標識MLR→RVLMニューロンとRVLM C1ニューロン間のシナプス接触が示唆されています。

a 空飛ぶ円盤の車輪が入ったケージ内を自由に移動する意識のあるラットのMLR→RVLMニューロンの光遺伝学的阻害。 b MLR → RVLM ニューロンにおける Cre 依存性の iChloC-mCherry 発現。 アスタリスク: 光ファイバーの先端の位置。 スケールバー: 1 mm (左)。 20μm（右）。 c 延髄におけるmCherry免疫反応性軸索の分布（左）。 腫れは、RVLM C1 ニューロン樹状突起および細胞体とほぼ反対でした (アスタリスク; 右)。 スケールバー: 1 mm (左)。 10μm（右）。 d iChloC-mcherry発現ラットにおける車輪走行中の2-s光遺伝学的阻害に応答した代表的な運動速度と心臓血管の変化。 WRR、ホイール回転数。 記録中のオーバーヘッドビューは補足ムービー 3 で報告されています。e eYFP 発現コントロール (n = 4) および iChloC-mCherry 発現雄ラットでの走行中の 2 秒間の光遺伝学的介入に応答した時間経過 (200 ミリ秒ビン) の変化(n = 7)。 灰色、試験全体で平均化された個々のデータ。 f 対照（45試験/4ラット）とiChloC-mCherry発現ラット（96試験/7ラット）の間の比較：ランニング中の2秒間の光遺伝学的介入の開始後の5秒間の積分ΔWRRおよびΔMAP。 照射前レベルは、レーザー照射直前の 2 秒間の平均値として決定されました。 横棒、平均値。 g 各実行試行における∫ ΔMAP 対 ∫ΔWRR のプロット。 iChloC-mCherry 発現ラットの多くのプロットは第 3 象限に分布しています。 h 対照とiChloC-mCherry発現ラットの間、および∫ ΔWRR と∫ ΔMAPのパターンの間の試験パーセンテージの比較。 i 安静時の∫ ΔMAP の対照 (39 試験/4 ラット) と iChloC-mCherry 発現ラット (69 試験/7 ラット) の比較。 データは、一元配置RM ANOVAに続いてホルム・シダックの事後検定またはフリードマンの一元配置RM ANOVAを介してランク別に分析され、続いてダネットの事後検定(e)、両側ウェルチのt検定(f)、二元配置で分析されました。 RM ANOVA に続いて Tukey 検定 (h)、または Mann-Whitney U 検定 (i)。 F / t / χ2 統計値および自由度を含む統計情報を補足表15に示します。 * P < 0.05 vs. 光遺伝学的介入直前の2秒平均照射前レベル（e）。 †P < 0.05 対各グループの他のすべての試験 (h)。 各パターンの対照に対して P < 0.05 (h)。 パネル (e – h) および (i) (= 照射前レベル) のベースライン値は、それぞれ補足表 13 および 14 に報告されています。 示されているデータは平均値 ± SEM です。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 図 (a) で使用されている脳切片画像は、「Paxinos G & Watson C. The Rat Brain instereotaxic Coords. 6th edn. (Amsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)」から改変されました。

光遺伝学的操作と遠隔AP測定の装備を備えた意識のあるラットは、直径36cmの水平回転輪を含む立方体形のケージ[45×45×40（高さ）cm]内で自由に移動できました（図5a）。 。 車輪の上で自発的に走行しているとき、またはケージの床で静止しているときに、MLR に 50 ms のパルスレーザー (10 Hz で 10 mW) を 2 秒間両側から照射しました 43。 この光遺伝学的アプローチは、Fos の免疫組織化学的染色によって MLR → RVLM ニューロン興奮を効果的に阻害することが確認されました。 Fos発現は、麻酔下で細胞体のChR2媒介光遺伝学的活性化によってMLR→RVLMニューロンで誘導され、この誘導されたFos発現は、これらのニューロンにおけるiChloCの同時光活性化によって抑制されました（補足図7）。

MLR→RVLMニューロンにiChloC-mCherry発現または対照eYFP発現を有する各ラットにおいて、実験は2〜4日間にわたって実施され、その中でレーザーパルスシリーズは走行中に合計9〜17回、安静時に5〜15回のトライアルが与えられた。 。 自発的な車輪走行中の光遺伝学的介入には、各ラットの試験間で、停止/減速後の再走行や、走行を停止した後の車輪の上に立つなど、さまざまなパターンの行動変化が続きました（補足図8a;補足動画3）。 ただし、2 秒間のレーザーパルス列の開始後 5 秒間「走り抜ける」という行動に遭遇する確率は、eYFP 発現コントロールでは 79% (50 ～ 100%、n = 4) でしたが、わずか 14 でした。 iChloC-mCherry発現ラットの%（0〜33%、n = 7）（補足図8b）。 対照的に、5秒間に運動活動が抑制される確率は、対照よりもiChloCラットの方が高かった（補足図8b）。 iChloC ラットのランニング試験の 37% (13 ～ 57%) で、5 秒以内に一時停止または減速を伴うランニングが見られましたが、この行動パターンはどのコントロールでも観察されませんでした。 レーザーパルス開始から5秒後の「走行を停止した後、車輪の上に立つ」ことは、対照では7％（0～21％）で観察されたが、iChloCラットでは24％（14～35％）で観察された。 さらに、7 匹の iChloC ラットのうち 6 匹の試験では、5 秒以内に車輪からケージの床に離れることが 8 ～ 30% で観察されましたが、対照ラット 3 匹は、試験の 29% で車輪から離れた 1 匹の対照を除いて、この行動をまったく示しませんでした。試練。

各ラットのすべての走行試験にわたる車輪回転速度（WRR）の変化と心血管の変化を平均することにより、車輪走行中のMLR→RVLMニューロンの光遺伝学的抑制が、HRに影響を与えることなく自発運動活動とAP上昇に抑制効果を及ぼすことがわかりました（図1）。 5d–f)。 WRRとAPの減少は両方とも照明の開始直後に発生し、平均して同様の時間経過動態を示したので（図5e、補足図8c）、運動の抑制がAP減少の原因である可能性は低く、またその逆も同様です。 一方、eYFP発現対照では、ランニング中に与えられた一連のレーザーパルスは、平均してWRRまたは心血管の変化に影響を与えませんでした（図5eおよびf、補足図8c）。 最後に、対照試験の20％（0～31％）、iChloCラットでは71％（62～82％）で、行動パターンに関係なく、光遺伝学介入後のWRRとAPの同時減少が観察された（図1）。 5gとh）。 これらの結果は、MLR → RVLM 神経伝達が、ランニング運動中の運動活動と交感神経心血管制御の調整に関与する中枢指令シグナル伝達を媒介していることを示しています。

対照的に、ラットが安静にしている間に与えられた一連のレーザーパルスは、対照またはiChloC-mCherry発現ラットのいずれにおいてもAPまたはHRに影響を与えませんでした（図5i;補足図9）。 したがって、MLR → RVLM 単シナプス経路は、心血管の基礎恒常性に寄与する可能性は低いです。

我々の機能神経解剖学的分析と、ラットでの光遺伝学的操作と組み合わせた生体内生理学的実験により、MLRニューロンが、随意運動中に体運動運動と交感神経の両方の流出を刺激する、中枢指令駆動の興奮性、少なくとも部分的にグルタミン酸作動性の信号をRVLMに伝達することが明らかになった。 MLR → RVLM 単シナプス経路の光遺伝学的刺激は、ランニング運動で見られるような運動および自律心血管反応を誘発しました。 さらに、MLR→RVLM経路を選択的に阻害すると、自発的な車輪走行中の自発運動活動が抑制され、昇圧反応が低下しましたが、安静状態では心血管の基礎恒常性には影響がありませんでした。 全体として、これらの発見は、皮質下のMLR→RVLM経路が、意志による中枢指令信号を中継し、それによって運動能力の向上に必要な自律心血管制御と体性運動肢制御の調整を仲介する中枢回路機構の重要な構成要素を構成していることを実証している。またはランニング運動。

図1cに示すように、MLR→RVLM経路に加えて、RVLMはPAGからの投影も受け取ります。 PAG は中枢指令のための別の皮質下回路を構成しているようですが 19、RVLM を投射する PAG ニューロンが運動中に自律神経調節に関与しているかどうかは不明であり、さらなる研究に値します。

体運動運動システムと自律神経制御システムは伝統的に異なるものであると考えられてきました44が、運動、運動、摂食、睡眠、闘争・逃走・凍結反応、疼痛反射などの脊椎動物の原始的な行動は、体性運動と自律神経の調整が特徴です。自律神経調節45、46、47。 したがって、機能的な脳の構造は、特定の行動に対する体性運動活動と自律神経活動の微妙な調整の根底にあると考えられますが、その組織化は現在ほとんど理解されていません。 この回路に関連する可能性として、ラットの二重経ニューロン追跡により、脳全体の別々の領域に体性運動系と交感神経運動系の両方に接続しているニューロン集団が存在することが明らかになりました48、49、50。 さらに、視床下部または中脳の領域の電気的または化学的刺激は、動物と人間の体運動運動と心臓血管の変化を同時に引き起こしました13、14、15、17、18。 PVN50、MLR15,49、RVLM、尾髄網様体48の外側傍巨細胞核（LPGi）など、以前に神経解剖学的または機能的に研究されている領域13、14、15、17、18、48、49、50は、体性自律運動の統合に参加し、それによってさまざまな行動に影響を与えます。 しかし、行動におけるこれらの領域の因果的役割や、これらの役割の根底にある脳の接続性は調査されていません。 本研究では、MLR→RVLM経路が、自発的なランニング運動における体性自律運動統合の基礎となる中心的なメカニズムであることを特定しました。 その結果、私たちの研究は、運動パフォーマンスを最大化するために必要な生理学的コンディショニングのための脳構造についての重要な洞察を提供します。

MLR → RVLM 経路は、移動運動や自発的なランニング運動のための自発的な中枢指令信号が体性運動神経系や交感神経系に影響を与える重要な接続を構成しているようです。 MLR→RVLMニューロン刺激によって引き起こされる体性運動神経放電と交感神経放電のさまざまなパターンによって証明されるように（図3b〜d）、この経路からの興奮性信号は、脊髄運動ニューロンと交感神経節前ニューロンに接続する別個の髄脊髄経路を駆動するようです。 しかし、MLR→RVLM経路を運動活動または交感神経性心血管反応と機能的に結び付ける固有の組織は不明であった。 それにもかかわらず、我々の追跡研究は、MLR→RVLMグルタミン酸作動性経路の標的となるシナプス後ニューロンにはRVLM C1ニューロンが含まれることを示しています（図1hおよび5c）が、RVLM非C1ニューロンもこの経路の標的である可能性があります。 RVLM の C1 ニューロンと非 C1 ニューロンは両方とも、脊髄の交感神経節前ニューロンに軸索投射を送ります 24。 MLR → RVLM 経路を介した中枢指令信号は、これらの交感神経前運動前 RVLM ニューロンを介した交感神経血管運動性流出を増加させる可能性があります。

体運動神経系調節のための MLR → RVLM ニューロンのシナプス後接続に関して、我々は、意識のあるげっ歯類では RVLM ニューロンの非選択的刺激によって運動を開始できないことに注目しており 51,52、この見解は、交感神経興奮性 PVN → RVLM の効果がないことによっても裏付けられています。ラットの行動に対する神経刺激（補足図6）。 したがって、MLR→RVLMニューロンによって駆動される運動には、この単シナプス経路によって特異的に制御され、実行髄髄脊髄運動回路に関与するRVLMニューロンの特殊な部分集団の活性化が必要であると考えられます。 MLR → RVLM ニューロンと脊髄運動ニューロンの間の重要な仲介者には、グルタミン酸作動性 LPGi ニューロンが含まれる可能性があります。 Capelli ら 35 は、このニューロン集団の条件付きアブレーションが、VGLUT2-Cre トランスジェニック マウスのグルタミン酸作動性 MLR ニューロンによって誘発される移動運動を抑制することを示し、グルタミン酸作動性 LPGi ニューロンが、グルタミン酸作動性 MLR ニューロンによって媒介される移動のポジティブな調整において調節的な役割を果たしていることを示唆しています。 私たちの実験で調査された RVLM は、Capelli らによって調査された LPGi の尾外側に連続的に配置されています。 以前の 35 の形態学的データと我々の研究（C1 ニューロンの分布および AAV 伝達 / 光学カニューレ移植のための脳領域に基づく）によると、標準的なマウスおよびラットの脳と同様に、顔面核の尾側端まで吻尾側に横たわっています。アトラス。 RVLM と LPGi は両方とも、相互接続された構造と管の拡張的なネットワークを特徴とする髄様網様体の一部であるため、MLR → RVLM ニューロンは、グルタミン酸作動性 LPGi ニューロンやその他のニューロンを制御する特定の RVLM ニューロン集団とシナプス接触している可能性があります。髄脊髄運動ニューロン。 運動制御LPGiニューロンがRVLMの内側部分に混在している可能性もある。 それらは、MLR → RVLM ニューロンによってシナプス後制御されている可能性があります。 全体として、MLR→RVLMニューロンを通って下降する中枢指令信号は、交感神経調節性RVLMニューロンの活性化を介して交感神経系を調節するが、その信号は副次的に別のRVLMニューロン集団を刺激する可能性があり、その結果、運動のためのLPGiを含む別個の髄脊髄回路ネットワークが活性化される。 運動活動と交感神経性心血管反応のためのMLR→RVLMニューロンからの個別の下流回路機構を正確に決定するには、さらなる研究が必要である。

移動は、さまざまな運動意志によって引き起こされる、逃避、追跡、探索などのさまざまな自発的行動の代表です。 自発的なランニング運動において重要な役割を果たすMLR→RVLM経路が他の運動行動にも関与しているかどうかは不明である。 それにもかかわらず、MLR の活性化は、逃走 53 および追跡 54 のための移動に確実に貢献します。 Caggiano ら 36 はまた、中脳水道周囲灰白質からの投射を受け取るグルタミン酸作動性 CnF ニューロンは逃避に必要な高速移動をサポートする一方、大脳基底核からの投射を受け取るグルタミン酸作動性 PPTg ニューロンはゆっくりとした探索的移動に必要である可能性があることを示唆しました。 したがって、MLR→RVLM経路は、異なる運動意志によって駆動される別個の回路から求心性入力を受け取る場合でも、これらのタイプの運動行動の体性運動と自律神経の結合の基礎となる共通のキーノードを構成している可能性があります。 現在のところ証拠は不足しているが、自発的なランニング運動のための MLR → RVLM ニューロンの活動に影響を与える上流回路には、視床下部オレキシン作動系 55 や側坐核 56 などの内的動機に関連する脳領域が含まれている可能性があり、どちらも軸索投射を持つ。 MLR33,57。 さらに、ヒトの被験者では補足運動野、運動前野、または運動野の刺激により交感神経興奮と連動した筋けいれんが引き起こされるが 16、中枢指令信号を伝達するための皮質と皮質下の接続に関する情報は得られていない。 さらに、中枢指令は「皮質照射」として終脳から発生すると推測されているが2、中枢指令信号の発生源となる部位については統一見解はない58。 中央コマンド信号をMLR→RVLMニューロンに中継する上流回路は、1世紀をはるかに超える未解決の問題である、自発的運動中の自律心血管調整の基礎となる脳メカニズムに向けてさらなる研究に値する（補足図10）。

すべての手順は、動物管理委員会 (参照番号: 15-Y-40、18-Y-11、19-Y-53) および遺伝子組換え実験安全委員会 (参照番号: 28-034、31-067、 32-061) 鳥取大学。 この研究では、日本エスエルシー株式会社の Sprague Dawley ラット (Slc:SD、雄および雌) を使用しました。 清水研究所サプライヤー株式会社から購入し、当社施設内で飼育しました。 すべてのラットは、25 °C の空調部屋で 12:12 時間の明暗サイクルで維持されました。 iChloC活性化を介した光遺伝学的阻害の効果を研究するための実験用のラットを除き、それらは標準的なケージで飼育されました。ラットは（離乳後）空飛ぶ円盤の車輪（直径36cm、Exotic Nutrition）が入ったケージで飼育されました。 食物と水は自由に摂取できるようにした。 すべての in vivo 実験は、25 °C の空調設備の整った実験室で行われました。

CMV プロモーターの下で、ChIEF-tdTomato (AAV2/1-CMV-ChIEF-tdTomato) および palGFP (AAV2/1-CMV-palGFP) で MLR ニューロンに順行性形質導入する AAV (ChIEF-tdTomato をコードする遺伝子カセットは R によって提供されました) McQuiston: Addgene#32846)、および iChloC-mCherry (AAV2/5-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry) による MLR → RVLM ニューロンの Cre 依存性形質導入 (iChloC-mCherry をコードする遺伝子カセットは P. Hegemann より寄贈されました。 Addgene#85467) については以前に説明されています 43,59,60。 これらの AAV の生成と精製は、ソーク研究所 (http://vectorcore.salk.edu/protocols.php) の修正された Gene Transfer Targeting and Therapeutics Core プロトコールに従いました。 必要なプラスミドを HEK293T 細胞にトランスフェクトし、OptiPrep (Axis-Shield) を使用して細胞の粗溶解物から AAV を精製しました。 メンブレンフィルター (Amicon Ultra-15 NMWL 50 K、Merck) による濃縮後の最終滴定は 2.1 × 1011 GC/mL (AAV2/1-CMV-ChIEF-tdTomato)、3.5 × 1011 GC/mL (AAV2/1) でした。 -CMV-palGFP)、および 3.4 × 1012 GC/mL (AAV2/5-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry)。 他のすべての AAV は、Addgene から入手しました (AAVrg-hsyn-EGFP、B. Roth 提供: Addgene#50465、7.4 × 1012 GC/mL; AAVrg-Syn-ChR2(H134R)-GFP、E. Boyden 提供: Addgene# 58800、8.0 × 1012 GC/mL; AAVrg-pgk-Cre、P. Aebischer 提供: Addgene#24593、9.5 × 1012 GC/mL; AAV; AAV2-Ef1a-DIO-EYFP、K. Deisseroth 提供: Addgene# 27056、3.0 × 1012 GC/mL; AAV5-EF1a-DIO-ChR2-eYFP、K. Deisseroth より寄贈: Addgene#35509、1.0 × 1012 GC/mL)。 ここで提供される Addgene 番号を持つプラスミドおよび AAV は、Addgene との物質移転契約に基づいて入手されました。

酸素中 1 ～ 5% イソフルランで麻酔をかけ、挿管し、人工換気したラット (6 週齢以上) (SN480-7、Shinano) を定位ヘッド ユニット (David Kopf Instruments, Inc. の 900LOS、または SR-6R) に配置しました。成重より）。 ＣＴｂまたは所定のＡＡＶ溶液を、校正済みの圧力マイクロインジェクションシステム（Ｎａｎｏｊｅｃｔ ＩＩ、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．）を使用して、対象の脳部位に注入した。 RVLM への注射では、後頭部を覆う皮膚を正中線で切開して延髄の背側表面を露出させ、続いて頭蓋底を覆う筋肉を解剖し、次に環椎を切開しました。 -後頭膜。 RVLM 注射の座標（台頭の吻側 1.0 mm、側方 1.8 mm、延髄背側表面の腹側 3.5 ～ 3.7 mm）は、顔面核の尾極のほぼ尾側に位置する座標に対応しました。 MLR (ブレグマまで尾側 8.0 mm、側方 2.0 mm、腹側 6.3 ～ 6.9 mm) への注射では、皮膚の正中線切開によって頭蓋骨を露出させ、頭蓋骨に 2 つのバリ穴を開けました。 脳に注入した溶液は次のとおりです: Alexa-555 結合 CTb (1.0 mg/1 mL PBS、C34776、Thermo Fisher Scientific) (23.0 nL × 4、RVLM)、AAV-CMV-ChIEF-tdTomato (46.0 nL × 4、MLR）、AAV-CMV-palGFP（46.0 nL×4、MLR）、AAV-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry（46.0 nL×4、MLR）、AAV-Ef1α-DIO-EYFP（46.0 nL×4、 MLR)、AAV-Ef1α-DIO-ChR2-eYFP (46.0 nL × 4、MLR)、AAV-Ef1α-DIO-ChR2-eYFP と AAV-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry の混合物 (1:1、46.0 nL) × 4、MLR)、AAVrg-hsyn-EGFP (23.0 nL × 3、RVLM)、AAVrg-Syn-ChR2(H134R)-GFP (23.0 nL × 3、RVLM)、および AAVrg-pgk-Cre (23.0 nL × 3) 、RVLM）。 注射後、マイクロピペットを５分間挿入したままにしてから引き抜いた。

CTb を注射したラットでは、経心灌流を受けるまで 7 ～ 11 日間の回復期間が与えられました。 RVLM 投影ニューロンにおける Fos 発現を調べる実験に使用された AAV 注射ラットには、トレッドミル運動トレーニング プログラムを開始する前に 7 日間の回復期間が与えられました。 麻酔または除脳状態での光遺伝学的実験に使用されるAAV注射ラットでは、実験前に少なくとも14日間の期間が与えられた。 意識実験におけるラットへの AAV 注射手順と、それに続く頭蓋内に光ファイバーカニューレ (コア直径 200 μm、CFML52U-20、Thorlab) を埋め込む追加手術。 MLR の両側照射用の 2 本の光ファイバーを、頭蓋骨に開けた 2 つのバリ穴を通して脳に垂直に挿入し (ブレグマの尾側 8.0 mm、側方 2.0 mm、腹側 5.5 ～ 5.8 mm)、配置されたネジと一緒に固定しました。歯科用セメントを使用して穴を囲みます。 PVN の片側照明の場合、ファイバーを同様に垂直に挿入し (ブレグマの尾側 1.9 mm、側方 0.3 mm、腹側 7.9 ～ 8.2 mm) 固定しました。 意識実験に使用されたラットは、以下に説明するAP測定用のワイヤレス圧力テレメーター(TRM54P、Millar, Inc./Kaha Sciences)を埋め込む別の手術を受けるまでに7日以上放置された。

イソフルラン麻酔し、挿管し、人工呼吸器を装着したラットにおいて、腹部正中切開を行って腹腔を露出させ、次に鈍的切開を行って下行大動脈に到達させた。 腸骨分岐部および左腎動脈分岐部の下で 2-0 シルクで大動脈を一時的に閉塞している間、テレメーターの圧力センサーを大動脈に挿入し、吻側に 1 ～ 2 cm 進め、外科用メッシュと外科用メッシュで固定しました。生体適合性のある外科用接着剤。 大動脈閉塞が解除された後、皮膚切開部を縫合して閉じた。 意識のあるラットでの実験は、テレメーターの埋め込みから少なくとも 1 週間後に実施されました。

自発的なランニング運動による MLR → RVLM 経路の興奮性を免疫組織化学的に研究するために、AAVrg-hsyn-EGFP を RVLM に両側注射した雄ラットに、週に 3 ～ 4 回、合計 2 回のトレッドミル運動トレーニングを実施しました。 14 ～ 18 日。 トレーニングの初日、ラットは後部に電気ショックグリッドが取り付けられた特注のトレッドミル (MK-680C; 室町) に少なくとも 30 分間置かれました。 次に、トレッドミルランニング運動を 10 m/min、傾斜 0°で 1 分間行い、その直後に運動開始のトリガーとして 30 秒間のブザー音 (1 Hz) を与えました。 このセッションは、ブザー音と運動開始との関連性をラットに学習させるために 3 ～ 5 回繰り返されました。 2 日目の訓練後、ラットは 1 日あたり 1 回のランニングセッションを受けました。 ランニングの速度と継続時間は、10 日間かけて徐々に増加し、それぞれ 20 m/分と 40 分になりました。 ２０ｍ／分で４０分間のトレッドミル運動を１回完了した後、残りのトレーニングセッションとして、ラットに１６ｍ／分で４０分間のトレッドミルランニング運動を行った。 各トレーニングセッション中に走行ペースがトレッドミルの速度を下回った場合、ショックグリッドを使用して足に穏やかだが嫌悪感のある電気刺激をラットに与えます。 しかし、ラットはグリッドに触れようとしたときに綿棒で優しくつつかれたので、ラットに与えられるショックはほとんどありませんでした。 その結果、これらのラットは訓練プログラムを完了し、いかなるショックやナッジも受けることなく自発的にトレッドミルを毎分16メートルで40分間走ることができるようになった。 最終トレーニング日とプロトコール日の間には、トレーニングを行わない 2 日間の期間が認められました。

プロトコール当日、ラットは「運動」群と「対照」群としてランダムに選ばれた。 運動ラットを、フットショックが一度も与えられていないトレッドミルに連れて行き、15分間の休息期間を維持した。 続いて、30 秒間のブザー鳴動期間の後、16 m/min で 40 分間のトレッドミル運動を行った。 ラットはトレッドミルの後部に近づかずに期間中ずっと走り続けていたため、このトレッドミル運動中はナッジは不要であった。 運動を行わなかった対照ラットはトレッドミルに連れて行かれましたが、運動はしませんでした。 運動または対照期間のオフセットから 90 分後、酸素中の 5% イソフルランの吸入によってラットに深く麻酔をかけ、すぐに経心臓灌流しました (後述)。

末梢神経活動と心血管パラメータを測定する手術のために、ラットは酸素中の 1 ～ 5% イソフルランで麻酔され、挿管され、機械換気されました。 右大腿動脈および静脈にカテーテルを挿入して、それぞれ圧力トランスデューサ（P23XL、Becton, Dickinson & Co.）を介してAPを測定し、薬物を注入した。 2 本の針電極を前肢に配置して ECG を記録し、そこから連続する R 波間の時間を使用して HR を計算しました。 ラットを定位固定ヘッドユニットに配置した。 RSNAを測定するために、左脇腹切開を通して左腎臓を後腹膜から露出させ、次に腎神経線維の束をステンレス鋼ワイヤで作られた双極電極に接続した。 L5 VRNAを測定するために、椎弓切除術を行って脊髄の下部腰部を露出させ、脊髄を取り囲む髄膜層を切開した。 左Ｌ５腹側根から得た神経束を注意深く分離し、絶縁双極ステンレス電極上に置き、次いで電極の遠位側の神経束を切断して結紮した。 ラットの L3 の尾側にある前根には交感神経節前ニューロンの軸索が存在しないため、L5 前根の放電は後肢骨格筋に向けられた運動ニューロンの活動を反映しています 61。 RSNA 信号と VRNA 信号は、150 Hz のバンドパス低周波フィルターと 1 kHz の高周波フィルターを備えた AC アンプ (MEG-5200、日本光電) を使用して増幅され、聞こえるようになりました。 露出した神経組織を鉱物油に浸漬した。

実験用ラットには、麻酔下でウレタン（６００ｍｇ／ｋｇ）およびα－クロラロース（６０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した。 無麻酔除脳条件下での実験用のラットでは、除脳手順中の脳出血を最小限に抑えるために両側頚動脈を結紮した。 頭頂開頭術後、脳を前丘レベルでブレードを用いて冠状に切片化した。 この切片の吻側のすべての神経組織および小脳を覆う皮質組織を吸引した。

ターゲット領域にレーザー光を届けるために、パルス発生器 ( SEN-7103; 日本光電または STOmk-2; BRC Co.）を、単一または分岐の光ファイバーパッチコードを介して脳に挿入しました。 挿入前に、各カニューレの先端におけるレーザー出力強度を測定器（ＬＰＭ－１００；ＢＲＣ社）で測定した。 両側性 RVLM 照明では、2 本のカニューレを脳幹の背側表面に垂直な角度で脳幹に挿入し (馬頭の吻側 1.0 mm、馬側方 1.8 mm)、カニューレの先端が表面から吻側腹側 3.0 ～ 3.2 mm の位置に配置されました。 MLR を照射するために、カニューレの先端を脳に垂直に挿入しました（麻酔をかけた非除脳ラットのブレグマに対して尾側 8.0 mm、側方 2.0 mm、腹側 5.5 ～ 5.8 mm、吻側 0.2 ～ 0.5 mm、および 2.0 mm除脳ラットでは、下丘と上丘の境界の外側、および下丘の背側表面の腹側3.5 mmの位置にあります。 すべての外科的処置が完了した後、ラットをイソフルランから取り出した。 実験プロトコルを開始する前に少なくとも 60 分間経過させた。

AAV-CMV-ChIEF-tdTomato または AAV-CMV-palGFP を MLR に両側注射した自発呼吸ウレタン麻酔ラットでは、RVLM に 5 ms パルスで 20 または 40 Hz の両側レーザー照射を行いました。 30代連続照射時のレーザー出力は 10 mW に事前設定されました。 AAVrg-Syn-ChR2(H134R)-GFP または AAVrg-hsyn-EGFP の RVLM への両側注射を受けたウレタン麻酔または除脳された無麻酔ラットにおいて、1 分間断続的に (1.5 秒間隔で 0.5 秒のパルス照射) ; 30 試合）、または 5 ms レーザーパルス（麻酔ラットでは 10 mW、除脳ラットでは 20 mW のレーザー出力）による 10、20、または 40 Hz での MLR の 15 秒間の持続光刺激を与えました。 除脳したラットは、臭化パンクロニウム（体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇ）の静脈内注入によって予め麻痺させた。 データ収集中、機械換気の頻度は 70 呼吸/分に設定されましたが、これは定期的な光刺激 (0.5 秒のレーザーオンと 1.5 秒のレーザーオフ) の頻度とは同期していませんでした。 これは、定期的な光刺激に対する RSNA 反応に対する肺の膨張に伴う交感神経流出の考えられる影響をランダム化するために実施されました 21,61。 刺激頻度の順序はランダムであり、操作間に少なくとも 10 分の間隔をあけました。

イオンチャネル型グルタミン酸受容体拮抗薬 2-アミノ-5-ホスホペンタン酸 (AP5; A5282; Merck) と水溶性 6-シアノ-7-ニトロ-キノキサリン-2,3-ジオン (CNQX; ab120044; アブカム) の混合物 (10生理食塩水中の各mM）をRVLMに両側注射して、RVLMにおけるグルタミン酸作動性伝達を阻害した。 注射は、NANOJECT II マイクロインジェクション システムを使用して、頭蓋骨に作られたバリ穴 (ブレグマの尾側 12.5 mm、側方 1.8 mm、腹側 10.5 ～ 10.8 mm) を介して経頭蓋的に、または上記のように延髄の背側表面を通して行われました。 生理食塩水または AP5/CNQX (46.0 nl/部位) の両側注射後、光刺激までの時間は 5 ～ 20 分でした。

データ収集が完了した後、先端の位置を事後確認するために、光ファイバーカニューレやマイクロピペットを脳に繰り返し挿入したり取り外したりして傷跡を作りました。 腎神経と前根束を電極と神経軸の間で切断し、それぞれRSNAとVRNAのバックグラウンドノイズを測定しました。 ラットは、ウレタンおよびα-クロラロースの追加の静脈内注入または酸素中の5%イソフルランの吸入によって深く麻酔され、その後、後述する経心臓灌流を受けた。

AAVrg-hsyn-EGFP または AAVrg-hsyn-ChR2-GFP を RVLM に両側注射し、光ファイバーカニューレおよび遠隔測定送信機を埋め込んだ雄ラットを、AP、HR の変化を観察する実験に供しました ( AP波から計算）、およびMLRまたはPVNがカニューレを介してレーザー照射されたときの意識状態での行動。 実験当日の前に、ラットを円形トラック上で 1 ～ 1.5 時間自由に移動させ、実験環境に慣れさせました。 トラックの内径と外径は 100 cm と 140 cm で、内壁と外壁の高さはそれぞれ 30 cm と 40 cm でした。 内壁は黒色の塩化ビニルを巻いたポリエチレン製で、外壁は透明なアクリル板であった。 トラックの地面は、表面が滑らかな深緑色または黒色のゴムシートで作られていました。

実験当日、MLR照明用の光ファイバーカニューレは、1.5mのモノラルまたは分岐光ファイバーパッチコード、1×1光ファイバーロータリーを介して、波長473nmのダイオード励起固体レーザーに接続されました。ジョイントとFC-FCパッチコード。 MLR照明用のレーザー出力は、埋め込まれたカニューレと同じレーザー伝達効率を有する他の光ファイバーカニューレを使用して事前に調整されました。 意識のあるラットは円形トラック内を自由に移動できるようにし、実験開始まで少なくとも 30 分間放置しました。 安静状態のラット（眠っていないか、歩行や毛づくろいなど活発に動いていない）では、ベースラインデータを15秒間収集した後、MLRに10、20、または40 Hzの5ミリ秒のレーザーパルスを片側または両側から照射しました。 光パルスは 15 秒間持続的に与えられるか、または 5 秒間のレーザーオンを 5 秒間隔で 5 回繰り返す方法で断続的に与えられました。 PVN → RVLM ニューロン興奮の影響を研究するために使用された他のラットでは、PVN が同様に片側にレーザー照射されました。 光遺伝学的介入中に 1 秒を超えてテレメトリー信号の切断が発生した場合、データは破棄されました。 光遺伝学的介入後に 1 秒以上切断された場合 (例、図 4f)、データは分析に含まれました。 実験日の各ラットでは、2 ～ 6 回の試行がランダムな順序で実施され、試行間には少なくとも 10 分の間隔が設けられました。 実験日は少なくとも 2 日あけました。

RVLM に AAVrg-hsyn-EGFP を、MLR に AAV-Ef1a-DIO-eYFP、AAV-Ef1a-DIO-ChR2-eYFP、または AAV-hsyn-EGFP の混合物を両側注射したイソフルラン麻酔の雄または雌ラットEf1a-DIO-ChR2-eYFP および AAV-Ef1a-DIO-iChloC-mcherry を機械的に換気し、大腿静脈を介してカニューレを挿入しました。 MLR照明のために光ファイバー先端を脳に挿入した(腹側からブレグマまで4.5mm)。 続いて、ウレタンとα-クロラロースの静脈内注入による麻酔下で、MLR に 50 ms パルスの青色レーザー (10 mW、 10Hz）。 照明をオフにしてから 45 分後、動物に 4% パラホルムアルデヒドを経心的に灌流し、その後脳を採取して免疫組織化学染色を行い、下記のように Fos 発現を標識しました。

若い雄ラット (生後 4 ～ 6 週齢) を、直径 36 cm の空飛ぶ円盤ホイール (Exotic Nutrition) が入ったアクリル製のガラス製ケージ内で集団飼育しました。 その結果、彼らは研究を受けると自発的にハンドルを握って走るようになった。 成熟（9 週齢以上）に達した後、これらのラットは MLR に AAV-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry または AAV-Ef1a-DIO-EYFP を、RVLM に AAVrg-pgk-Cre を両側から注射されました。光ファイバーカニューレとテレメトリ送信機（前述）が埋め込まれています。 実験は暗期中に行われました。 実験当日、光ファイバーカニューレはパッチコードとロータリージョイントを介してレーザーに接続され、MLR照明の出力は10 mWに事前設定されました。

意識のあるラットを、空飛ぶ円盤の車輪が入ったアクリルガラス製の立方体状のケージ（45×45×40（高さ）cm）内で自由に歩き回らせた後、少なくとも30分間放置した。実験が始まりました。 車輪の端に4つの小さな突起を等間隔に設置。 これらは、ケージ内に配置され、バネを介して力変換器 (FT03; Grass Instruments) に接続されたバーにわずかに接触可能でした。 その結果、ホイール回転速度 (WRR) は、突起とバーの間の接触による張力発現イベント間の時間間隔で計算できました。 ラットが自発的に車輪の上を走っているか、地面で休んでいる間（寝たり毛づくろいなどで動いたりしていない）、MLR を 10 Hz の 50 ms パルスで 2 秒間両側から照明しました 43。 走行中の照明は、自発走行の開始から少なくとも 2 秒後に始まりました。 1 日に、安静時または走行中に 5 ～ 13 回の試験を各ラットに対してランダムに実施し、試験間に少なくとも 5 分の間隔をあけました。 各ラットの実験日は少なくとも 2 日離れていました。

追加のウレタンの静脈内注入または酸素中の5%イソフルランの吸入によって深く麻酔したラットに、ヘパリン添加生理食塩水、続いて0.1Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS; pH7.4)中の4%パラホルムアルデヒドを経心臓的に灌流した。 脳を取り出し、同じ固定液で4℃で2時間後固定し、その後30％スクロース溶液に4℃で24〜48時間移した。 クライオスタット（CM1900、Leica、Wetzlar、ドイツ、または HM505 E、GMI、Ramsey、MN、USA）を使用して、厚さ 30 μm の冠状または矢状脳切片を作成しました。

免疫蛍光染色では、組織切片を PBS で洗浄し (2 回洗浄 × 10 分)、抗体溶液 (0.3% Triton X-100、2.5 g/L ラムダカラギーナン、200 mg/L NaN3、10 mL を含む PBS) 中でインキュベートしました。 L 通常のロバ血清) 室温で 2 時間。 次に、切片を一次抗体溶液中で 4 °C で一晩インキュベートしました。 翌日、切片を 0.03% Triton X-100 を含む PBS で洗浄した後 (2 × 10 分)、二次抗体溶液中で暗所、室温で 1 時間インキュベートし、その後 PBS で再度洗浄しました ( 2×10分）暗所で。 最後に、切片をスライドにマウントし、液体封入剤 (P36930; Thermo Fisher Scientific) でカバースリップをかけました。 染色切片のデジタル画像は、デジタル顕微鏡 (BZ-9000 または BZ-X710; Keyence) または共焦点顕微鏡 (LSM780; Carl Zeiss) で取得しました。

使用した一次抗体は次のとおりです:ニワトリ抗チロシンヒドロキシラーゼ (1:500; ab76442、Abcam)、ヤギ抗コリンアセチルトランスフェラーゼ (1:100 または 1:200; AB144P、Merck)、ヤギ抗 GFP (1:1000) ; GTX26673、GeneTex、アーバイン、カリフォルニア州、米国）、ヤギ抗 tdTomato (1:500; AB8181、Sicgen)、マウス抗 Cre Recombinase (1:1000; MAB3120、Merck)、ウサギ抗 c-Fos (1: 400; 2250s、Cell Signaling Technology）、ウサギ抗 GFP（1:1000; A-6455、Invitrogen）、ウサギ抗 RFP（1:1000; 600-401-379、Rockland）、ウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ（1 ：1000; AB152、Merck）、およびウサギ抗小胞性グルタミン酸トランスポーター 2（1:500; AF860、Frontier Institute）。 以下の二次抗体を使用しました (宿主種、ロバ): 抗ニワトリ DyLight 405 (1:250; 703-475-155、Jackson ImmunoResearch)、抗ニワトリ Alexa Fluor 488 (1:500; 703-545-155、Jackson) ImmunoResearch)、抗ヤギ Alexa Fluor 405 (1:500; ab175665、Abcam)、抗ヤギ Alexa Fluor 488 (1:500; ab150129、Abcam)、抗ヤギ Alexa Fluor 555 (1:500; A-21432、 Thermo Fisher Scientific または ab150130、Abcam)、抗マウス Alexa Fluor 488 (1:500、ab150109、Abcam)、抗マウス Alexa Fluor 555 (1:500; ab150106、Abcam)、抗ウサギ Alexa Fluor 488 (1: 500; A-21206、Thermofisher Scientific または ab150073、Abcam）、および抗ウサギ Alexa Fluor 555（1:500; ab150074、Abcam）。

中脳の細胞マッピングと計数のために、ブレグマから尾側 8.0 mm の冠状切片を研究しました。 切片の吻尾側レベルは、大脳水道、水道周囲灰白質、三叉神経の感覚根、上小脳脚、上丘核および下丘核などの適切なランドマークを参照して検証されました。 中脳におけるCTb標識細胞の分布を8匹のラットで調査した。 8 匹のラットのうち 3 匹において、ChAT 免疫反応性細胞の分布も調査されました。 CTb標識およびChAT免疫反応性細胞は、再び適切なランドマークを使用して、PaxinosおよびWatson62が提供する標準切片に転写される前に、元の切片のデジタル画像上にマッピングされました。

MLR 内の GFP または ChAT 免疫反応性集団内の Fos 免疫反応性細胞の数をカウントするには、ラットあたり 1 つのスライスを 2 ～ 4 枚の連続するスライスからランダムに選択します。 免疫反応性細胞は、上記のように元の冠状断面のデジタル画像上にマッピングされました。 CnF および PPTg 内のマッピングされた細胞の数（その範囲はラット脳アトラス 62 に従って、ChAT 免疫反応性細胞の分布および適切なランドマークを参照することによって定義されました）を、二重盲検法で両側から数えました。 。

図（図1a、c、e、i、2a、e、3a、4a、5a、補足図2a、6a、7a、10）で使用されている脳切片画像は、Paxinos and Watson'sの図を参照して作成されました。ラットの脳のアトラス62。

in vivo 光遺伝学的実験を通じて、すべてのアナログ測定値は AD コンバーター データ収集システム (PowerLab 8/30 または 8/35; ADInstruments) を介してデジタル化され、コンピューターのモニターに継続的に表示され、1 kHz のサンプリング レートでデジタル記録されました。 LabChart ソフトウェア (v8.0 または 8.1.16; ADInstruments) を使用するハードディスク。 MAP と HR は心拍ごとに事後的に計算され、1 kHz でリサンプリングされました。 意識のあるラットを使用した実験の俯瞰図は、コンピューターに接続された HD Web カメラ (C920; Logicool) で連続的にビデオ撮影され、ビデオ データは 10 フレーム/秒 (fps) の速度で保存されました。

麻酔をかけたラットまたは除脳したラットで行われた光遺伝学実験では、ベースライン値は光遺伝学的介入前の 15、30、または 60 秒間の平均から得られました。 光刺激に対する RSNA および VRNA 応答を調べるために、1 分間の間欠刺激プロトコル中の光刺激期間の各短い期間 (0.5 秒) の直前の 1 秒間の平均値も決定されました。 意識のあるラットにおけるChR2活性化による光遺伝学的刺激の効果を研究する実験では、レーザー照射開始前の15秒平均からベースライン値が得られました。 意識のあるラットにおけるiChloC活性化による光遺伝学的阻害の効果を研究する実験では、レーザー照射直前の2秒間の平均値がベースラインとして決定されました。 ベースライン値は補足表 1 ～ 14 に示されています。

光刺激に対する RSNA および VRNA の応答を定量化するために、これらの末梢神経活動の全波整流信号およびバックグラウンド ノイズ信号が取得された後、RSNA または VRNA のノイズ成分が整流信号から差し引かれました。 光遺伝学的介入に対する RSNA および VRNA の応答は、ベースライン値からの相対変化として定量化され、100% として表示されました。 追加の手順、つまり重ね合わせおよび平均化分析を実行して、1 分間の間欠刺激プロトコル中の 0.5 秒間の光刺激に応じた RSNA および VRNA を定量しました。 ベースラインからのRSNAまたはVRNAの相対的な変化は、0.5秒の光刺激の各期間に応じて1 kHzでリサンプリングされた後、相互に重ね合わされ、その時点で平均されました（図2c）。 平均RSNA変化のAUC値も、重ね合わせて平均化した分析後の期間中のベースラインからのRSNA変化の増加を統合することにより、光刺激に対するRSNA応答の指標として計算されました（図2c）。

意識のあるラットにおける光遺伝学的刺激の効果を研究するために、実験中にビデオが 10 fps で記録されました。 これらは、マニュアル（SMART ver. 3.0; Panlab）に従ってビデオ追跡システムを使用して、運動速度を計算するために分析されました。 ビデオシーケンスの各画像内のラットの輪郭を決定するために、ラットのいない実験領域（円形トラック）の画像が参照として使用され、ラットが含まれる実験中のビデオ画像のいずれかと比較されました。 その後、両方の画像間の差異がシステムによって検出されました。 各画像内のラットの質量の中心を連続的に検出することにより、200 ミリ秒にわたる動きの追跡が達成されました。 続いて、円形トラックにおけるラットの瞬間速度を平滑化せずに計算した。 意識のあるラットにおける光遺伝学的阻害の効果を研究するために実験中に記録されたビデオを使用して、上記の方法を使用して計算されたWRR値を検証しました。

注射が標的領域を外した場合、光ファイバーの先端の位置が不適切であった場合、1秒を超える光遺伝学的刺激中にテレメトリー信号の切断が発生した場合、またはラットが自発的に車輪の上を走行しようとしない場合のデータは、結果から除外された。

すべての測定値は Excel (Microsoft) にエクスポートされました。 すべての統計分析は SigmaPlot 14.0 (Systat Software, Inc) で実行されました。 独立したグループ間の比較では、データが正規分布している場合はウェルチの t 検定 (シャピロ・ウィルク検定を使用して評価)、正規分布していない場合はマン・ホイットニーの U 検定によってデータを分析しました。 試験間の対応のあるサンプルについては、対応のある t 検定によってデータが分析されました。 試験間で繰り返されたサンプルまたは時間経過の変化については、データは一元配置反復測定分散分析 (RM ANOVA) またはフリードマン一元配置 RM ANOVA によって、正規性 (シャピロ-ウィルク検定) および/または等分散の仮定 (ブラウン・フォーサイス検定) は ANOVA では満たされませんでした。 独立したグループ間の試験間で繰り返されたサンプルについては、データは二元配置 RM ANOVA によって分析されました。 必要に応じて、これらの ANOVA 手順の後に、Dunnett 検定、Holm-Sidak 検定、または Tukey の事後検定が続きました。 すべてのテストは両側性でした。 各グラフを図で表すために使用されるテスト、および F/t/χ2 統計値および自由度を含むその他の統計情報を補足表 15 に示します。 P < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。 データは標準誤差を含む平均値 (SEM) として表されます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究に関連するすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルで提供されます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

交感神経および心血管反応の分析に使用されるすべてのコードは、OSF: https://osf.io/tuhgm/ で入手できます。

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本研究は、JSPS 科学研究費補助金 基盤研究(B) (21H03321) (SK) の助成を受けて行われました。 a JSPS 科研費科学研究(B) (18H03151) (SK); a JSPS 科研費若手研究(A) (15H05367) (SK); JSPS 科研費 挑戦的研究（萌芽） (20K21759) (SK); 日本学術振興会科研費科学研究費補助金(C) (22K06470) (N.Ka.); 日本学術振興会 科研費 基盤研究(C) (19K06954) (N.Ka.); a JSPS 科研費科学研究(B) (20H03418) (KN); AMED (JP21wm0525002 to N.Ka; JP21gm5010002 to KN); JST ムーンショット研究開発 (JPMJMS2023 to KN); および武田科学財団（SK）からの助成金。 実験と手動二重盲検細胞計数にご協力いただいた山根由依氏、丸山幸司氏、大竹篤樹氏、小野由美氏、花井絵里氏、また共焦点顕微鏡の使用については、鳥取県が管理する鳥取バイオフロンティアに感謝いたします。システム。

鳥取大学医学部統合生理学教室

Satoshi Koba, Nao Kumada, Emi Narai & Tatsuo Watanabe

鳥取大学大学院医科学研究科統合生命科学分野

熊田さんも

名古屋大学大学院医学系研究科統合生理学教室

Naoya Kataoka & Kazuhiro Nakamura

名古屋大学高等研究院、名古屋

Naoya Kataoka

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SKがこの研究を発案した。 SK と N.Ku は、N.Ka からの意見をもとに実験を設計しました。 KNSK、N.Ka.、KN、TW が学習教材を作成しました。 N.Ku. SKとSKは実験を実施し、データを分析しました。 SK、N.Ku.、EN が図を用意しました。 SK、N.Ku.、KN がデータについて議論しました。 SK と KN は、共著者全員からの意見を取り入れて原稿を書きました。

Correspondence to Satoshi Koba.

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

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転載と許可

Koba, S.、Kumada, N.、Narai, E. et al. 運動活動と交感神経性心血管反応を駆動する脳幹単シナプス興奮性経路。 Nat Commun 13、5079 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32823-x

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受信日: 2021 年 9 月 10 日

受理日: 2022 年 8 月 18 日

公開日: 2022 年 8 月 29 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32823-x

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自律神経臨床研究 (2022)

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