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Jun 14, 2023

スペックルイメージングサブの使用

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 2613 (2023) この記事を引用

611 アクセス

メトリクスの詳細

微生物コロニーの成長は、コロニーの端にある細胞の活動によって促進されます。 ただし、このプロセスは、コロニーの特定の染色または断面化が行われない限り見ることができません。 スペックル イメージング技術は、コロニー内の微生物の活動が増加しているゾーンを視覚化できる非侵襲的な方法です。 この研究では、レーザースペックルイメージング技術を使用して微生物コロニーの成長を記録しました。 この方法は、ビブリオ ナトリジェンス、大腸菌、黄色ブドウ球菌の 3 つの異なる微生物でテストされました。 結果は、スペックル分析システムが微生物コロニーの増殖を記録できるだけでなく、コロニーのさまざまな部分での微生物の増殖活動を視覚化できることを示しました。 開発されたスペックルイメージング技術は、コロニーの中心から周辺部に移動する「微生物の活動が最も高い」ゾーンを可視化します。 この結果は、コロニー増殖の以前のモデルの精度を確認し、コロニー内の微生物の活動を分析するためのアルゴリズムを提供します。

コロニー サイズの成長は、寒天培地上での微生物の活動を特徴付けるための基準として使用されます。 コロニー サイズの成長は、通常、さまざまな時点でライブ画像を記録し、コロニーのサイズを比較することによって監視されます。 このイメージング技術を採用し、画像は高解像度カメラまたはフラットベッド スキャナーによって取得されます1、2。 重要な検出時間、コロニー サイズ、増殖速度、および最大コロニー サイズがパラメーターであり、既存のライブ イメージング方法を使用して定量化できます。

コロニーの成長を説明するモデルがいくつかあります 3、4、5。 多くのモデルでは、微生物のコロニーの成長は不均一であると説明されています。コロニーの成長は微生物の活性領域に依存し、微生物の活性領域は培地からの栄養供給に依存します。 たとえば、コロニーの端での微生物の増殖は、周囲の培地からの栄養素の絶え間ない供給や側方の培地への細胞の絶え間ない押し込みにより、中心部よりも活発です。 コロニーの微細な構造は、これらの推定の多くを裏付けています。 酵母コロニーの中心にある細胞は増殖を停止し、生存能力を失いますが、同じコロニーの端にある細胞は生きていて成長（増殖）を続けます6。 コロニーのさまざまな部分における微生物活動の違いは、既存のライブイメージング手法では正確に視覚化できません。 現在、コロニー内のさまざまな微生物の活動は、コロニーの断面作成と生存率染色などの侵襲的手法を使用してのみ調べることができます6。

照射面のさまざまな部分から反射または散乱するコヒーレント光によって生成される干渉パターンがレーザースペックルです。 レーザースペックルを照射された物体の散乱特性が時間の経過とともに変化しない場合、スペックル画像も変化しません。 散乱体が自発的に移動すると (ブラウン運動など)、一部のスペックルは変化し始めます (形状、強度)。 物体の散乱特性の変化により、時間変化するスペックルが生成されます。 つまり、外部のイベントや影響、および測定表面で直接発生するプロセスによって、スペックル画像の変化が生じる可能性があります7。 この現象に関して、レーザースペックルイメージング技術は、時間とともに変化するレーザースペックルパターンを分析することにより、光学的に不均質な媒体中の微生物の活動を監視するのに有用であることが証明されています。

レーザースペックルイメージング技術は、医療および食品の安全性分析のための新しい技術です。 これにより、微生物の増殖の早期検出 8、リンゴ果実の真菌感染の特定 9、硬化症患者の末梢血流の測定 10 が可能になります。

この研究では、スペックル イメージング技術を使用して、微生物コロニーの成長と構造的特徴を記録しました。 その結果、開発したスペックル解析システムは微生物コロニーの増殖を記録できるだけでなく、コロニーのさまざまな部分における微生物の増殖活動を視覚化できることがわかりました。 スペックルイメージングにより、コロニーの成長は中心ではなく端での細胞増殖によって引き起こされることが明らかになりました。 この結果は、コロニー増殖の以前のモデルの精度を確認し、コロニー内の微生物活動分析のためのアルゴリズムを提供します。

実験では次の微生物株を使用しました: Escherichia coli ATCC® 8739 (E. coli)、Vibrio natriegens DSM 759 (V. natriegens)、および黄色ブドウ球菌 ATCC® 6538P (S. aureus)。 細菌培養物を寒天プレート上で維持した。 大腸菌および黄色ブドウ球菌は、Bacto Peptone 10 g/l、酵母エキス 5 g/l、寒天 20 g/l (すべて Biolife, Italy)、および NaCl 5 g/l (Sigma,ドイツ）。 Weinstock et al.11 が示唆するように、V. natriegens を寒天化 NB 塩ブロス、Difco Nutrient Broth 8 g/l、NaCl 15 g/l 上で室温に維持しました。

すべての微生物種を単一コロニーからそれぞれの液体培地で継代培養し、+ 30 °C で一晩培養しました。 段階希釈した細菌培養物をペトリプレートに接種して、プレートあたり 20 ～ 200 個のコロニーを生成しました。 細菌を接種したペトリプレートを + 30 °C のインキュベーター (Herracell 240-i、Thermo Scientific) 内に置きました。 コロニーの成長は、635 nm レーザー照明 (「レーザー スペックル画像および広帯域照明下での画像をキャプチャするための実験システム」の説明を参照) およびフラットベッド ドキュメント スキャナー (CanoScan 4400f、Canon) によって並行して監視されました。 Auto Clicker アプリを実行することで、15 分または 30 分ごとの自動プレート スキャンが保証されました。 写真の解像度は 600 DPI でした。

実験用レーザースペックルイメージングシステムは、白色光 LED と赤色レーザー照明の下でマクロスケール画像をキャプチャするために組み立てられました。 このシステムは、マルチモード レーザー光源、白色 LED 光源、35 mm C マウント レンズ @F18、光減衰器、試験用寒天プレート (細菌を接種)、および CMOS カメラで構成されます (図 1)。 レーザースペックルは、コヒーレンス長 30 cm の直線偏光 635 nm マルチモード ダイオード励起固体レーザー (出力最大 300 mW) によって生成されました。 光減衰器を使用して、画像取り込みに最適な露光を実現し、照射されたプレートの加熱効果を回避し、寒天プレート表面全体で散乱レーザー光の出力密度 3 ～ 5 mW/cm2 を実現しました。 表面上のレーザービームの直径は 9 cm を超え、標準的なペトリ プレート全体を均一に照射します。 システムの主なコンポーネントを図 1 に示します。スペックル画像は、さまざまな継続時間 (25 ～ 70 時間) での実験のために 30 秒間隔で CMOS カメラによってキャプチャされました。 露光時間は 1 秒に設定されました。 レーザー照明とレンズ絞りに応じて選択されました。 カメラの解像度、レンズの絞り、ペトリ皿までのカメラの距離、結果として得られる関心領域などの光学設定のパラメーターは、レーザースペックルを検出するための適切な空間解像度を達成するために選択されました。 レンズ倍率は0.2倍に設定しました。 F18 の絞り値は、画像の鮮明さ、スペックル サイズ、必要な露出の間の最適なバランスとして選択されました。 これは、空間分解能が 9 μm、スペックル サイズが 33 μm という結果になります。

細菌の増殖中のスペックル画像をキャプチャするための実験ワークフロー。 (A) シングルコロニーを LB 培地に接種し、一晩培養 (+ 30 °C)。 (B) 寒天化 LB 培地上での一晩培養物の希釈および接種。 (C) 635 nm レーザーおよびフラットベッド スキャナーで取得したスペックル画像によるサーモスタット + 30 °C の寒天プレート上のコロニーの成長。 D 画像処理とデータ分析 (MATLAB 環境): コロニー サイズ、成長速度の検出、スペックル信号のフィルタリング、スペックル移動の識別など。

以前の研究で、著者らは、コロニー内の細菌の活動とその影響を検出するのに役立つ高感度相関サブピクセル分析について説明しました8,12。 実験のフィールド全体 (ペトリ皿) は、N × N ピクセルの小さなセクションに分割されました。 以下の手順はセクションごとに個別に実現されました。 実験の開始から終了まで、N × N ピクセルの連続画像間で 2 次元の正規化相互相関が実行されました 13:

ここで、a(x,y) と b(x,y) はシーケンス内の 2 つの隣接するフレーム、\(\overline{a}\) と \(\overline{b}\) はこれら 2 つのフレームの平均値です。 u と v は、それぞれフレーム a(x,y) と b(x,y) の間の x と y に向かう空間変位です。

相互相関ピークの正確なシフトを見つける必要がありました。 この値は、連続する NxN ピクセル画像間で発生する変化を特徴づけます。

オフセットのより正確な値を見つけるために、相互相関関数 14 のピーク付近で放物線補間が実行されました。

ここで、 \({a}_{u}\) と \({b}_{u}\) は放物線係数です。

隣接する NxN ピクセル画像の各ペア間で得られたオフセットは、実験の開始から終了まで累積されました。

シーケンス全体の連続する N × N ピクセル画像に対して説明したアルゴリズムを実行すると、「時間信号」が作成されます。

このアルゴリズムは、実験フィールド全体のすべての N × N ピクセル セクションに対して実装されました。 したがって、実験の考慮されたフィールドの代わりに、時間が 3 次元である「時間信号」からの 2 次元配列が取得されました。

局所的な極値を見つけて、局所的な過渡スパイクの影響を回避するには、信号を平滑化するのが得策です15。 信号エンベロープ関数を使用しました (図 2)。 この目的には、移動二乗平均平方根手法または別の同様のアルゴリズムを使用できます。

ここで、N はウィンドウの長さ、n は現在のサンプル、k はウィンドウ内で実行されているインデックスです。 したがって、N (ウィンドウの長さ) が信号の平滑化の程度に影響します。 RMS 手法を実行するときに外れ値を回避するために、切り捨て平均手法を採用するため、極値を切り捨てることができます16。

左上: アルゴリズムを使用して取得された信号 (青) とそのエンベロープ (赤)。 (コロニーセンターからの信号)。 緑色の線は、アクティビティが最大になった時間を示します。 図は、黄色ブドウ球菌コロニーからのシグナルを示しています。 同様のスペックル信号パターンが大腸菌およびナトリジェンス菌でも観察されました。 左下: スペクトログラムは、短時間フーリエ変換 (STFT) を使用して時間周波数領域で信号を表現したもので、時間と周波数における信号とノイズの動作を同時に観察できます。 右側: アルゴリズムを使用して取得したノイズ (コロニー外) (上) とノイズ スペクトログラム (下)。

図 2 では、信号 (コロニー内部) とノイズ (コロニー外部) を時間領域と周波数領域の両方で比較することもできます。 信号はノイズ レベルよりもはるかに高くなります。

まず、確立されたレーザースペックルイメージングシステムが微生物コロニーの増殖に影響を与えないかどうかをテストしました。 これを検証するために、レーザー スペックル システムによって推定されたコロニーの成長半径が、よく知られたフラットベッド スキャナー画像システムである参照方法を使用して得られた結果と比較されました。 この目的のために、微生物を単一コロニーから一晩継代培養し、段階希釈し、ペトリ皿に接種して単一細胞からのコロニー形成を観察するか（プレートあたり約 20 ～ 200 コロニー）、または段階希釈からのスポットをペトリ皿に適用しました。プレートを作成し、マクロコロニーを取得します。 寒天培地上のミクロおよびマクロコロニーを、スペックルイメージングシステムおよびフラットベッドスキャナー（Canon Canoscan4400r）上で並行して同じインキュベーター内で増殖させた。 V. Natriegens、E. coli、および S. aureus のコロニーの増殖が記録され、サブピクセル相関アルゴリズム (「スペックル画像を時間信号に変換するアルゴリズム」で説明) を使用してスペックル パターンが分析されました。 結果を図 3 に示します。

時間の経過に伴うコロニーの成長半径のダイナミクス。 E. coli、V. natriegens、および S. aureus のコロニー半径は、レーザースペックル画像解析 (青) またはフラットベッド スキャナー (Canon 4400、600 DPI) で撮影した画像 (赤) によって測定されました。

テストしたコロニーの増殖を比較すると、両方のシステムで非常に類似した結果が得られました。 したがって、確立されたレーザースペックルシステムは微生物コロニーの成長に影響を及ぼさないと結論付けることができます（図3を参照）。 スペックルイメージング装置の下とフラットベッドスキャナー内で成長した微生物コロニーの半径方向の成長速度を比較しましたが、半径方向の成長速度には有意な差はありませんでした（t 検定、p > 0.05）。補足表 1 を参照してください。

さらに、成長するコロニーのスペックル信号がコロニー内の細胞数と相関するかどうかを分析しました。 レーザースペックル画像の最大信号値の時間をマクロコロニー内の初期細胞数と比較しました（図4を参照）。 信号値が最大になる時間は、信号アクティビティが最大に達する時間として定義されます。 一晩大腸菌培養物を連続希釈し、マクロコロニーとしてLB寒天培地上に接種した(各接種材料の体積は5μLであった)。 マクロコロニーの成長は、レーザースペックルイメージングシステムを使用して記録されました。 各マクロコロニーの最大シグナル値の時間を決定し、マクロコロニーあたりの初期細胞数に対してプロットしました。 3 つの独立した接種シリーズのシグナル ピーク時間の平均値と標準偏差を計算しました (図 4 を参照)。

レーザーイメージングシステムによって得られた最大シグナル値（左のグラフの赤線と右のグラフの青丸）の時間とコロニー内の大腸菌細胞の初期数の依存性。

最初の結果は、スペックル イメージング システム内でのコロニーの成長がフラットベッド スキャナー内での成長と同じであることを実証しました。 それらの間のわずかな違いは、コロニーの個々の成長から生じ、プレート内のコロニーの局在化または最も近いコロニーとの距離によって影響を受ける可能性があります 17。 なお、スペックル信号の最大信号値の時間は、コロニー内の初期細胞数に依存する。 コロニー内の初期の細胞数が多い場合、最大スペックル信号に到達するまでに必要な時間は短くなります。 一方、初期のセル数が少ない場合は、スペックル信号の最大値に到達するまでに時間がかかります。 コロニーの増殖が 20 時間以上続いても (大腸菌については図 4 を参照)、スペックル信号は一度最大値に達し、「回復」することはありません。

レーザースペックル画像のサブピクセル相関によって得られた、細菌の活動を特徴付ける信号は、コロニー内で増加し、最大値に達した後、減少しました。 信号強度は顕著な時空間分布を示した。 コロニーの異なる部分では、異なる最大シグナルピーク時間がありました。 最大活性ピークは最初にコロニーの中心で観察されました。 時間の経過とともに、活動の「波」はコロニーの中心から端に移動しました（図5および6を参照）。 スペックル信号のこの時空間的挙動は、試験したすべての微生物コロニー（黄色ブドウ球菌、大腸菌、ナトリジェンス菌）内で観察されました。 スペックルシグナル移動の構造に関する詳細な分析が、3 つの異なる微生物種 (V. natriegens、E. coli、および S. aureus) のいくつかのコロニーに対して行われたにもかかわらず、シグナルの移動はコロニーの中心から端に向かって行われます。あらゆる微生物コロニーの特徴。 補足図S1は、約25〜30のコロニーを含むペトリ皿の一部の例を示しています。 サブピクセル相関分析後の各コロニーは、上記のアクティビティ リング効果の形成を示しています。

黄色ブドウ球菌コロニー全体にわたるスペックル信号の時空間分布。 上の行: コロニー内のさまざまなポイントでのシグナルのダイナミクスの経時変化 (グラフ中央の白い星)。 緑色の線は最大アクティビティを示し、その後シグナルは減少します。 中段: コロニー成長中の活動の変化。 下の行: 生のスペックル画像。

黄色ブドウ球菌コロニーの増殖中のコロニーの活動のピーク（活動の減少の開始）の時間。 上の画像 - 2 次元の時空間画像。 下の画像 - 時間の関数としてのピーク活動。 シグナルの同様の時空間的挙動は、大腸菌およびナトリジェンス菌のコロニー内でも観察されました。

コロニー全体の活動の減少が始まる時刻を選択し、それらを対応する座標を含む 2 次元空間マップ。

中心の周囲に高活性の「リング」が形成され、成長するコロニーの前面とともに移動します。 色は活動が減少し始めた時刻 (時間単位) を示します。青色 (中央) は最も早いもの、赤色は最も遅いもの (コロニーの端) を表します。

マップ上の最初の減少の位置は、微生物コロニーの増殖の開始点として想定できます。 この開始点または中心の座標がわかれば、時間の関数としてコロニーの成長曲線を得ることができます。 ただし、コロニーの成長はさまざまな要因（酸素と栄養素の利用可能性、ブラウン運動、コロニー内の隣接する細胞からの押し引き、コロニー内の細胞の成長と増殖の非同期性など）に依存するため、結果として得られる曲線には、ある程度の値のばらつきがあります (図 6、下のグラフ)。 したがって、移動メディアン フィルターが滑らかな曲線データに適用されました15。

ここで、N はウィンドウの長さ、n は現在のサンプルです。 中央値は、一連の数値を昇順に並べ替えたときに中央に位置する数値です。 つまり、数値セット内の要素の半分は中央値以上であり、残りの半分は中央値より大きくありません。

この方法が適用された理由は次のとおりです。 (1) 曲線を直線や放物線などの特定の形状に当てはめようとするものではありません。 (2) 移動平均とは異なり、外れ値を考慮しません。 。

「リング」効果は、テストした 3 種類の細菌すべてで得られました。 観察された主な違いは成長率でした (図 7)。

3 ～ 4 個の V. natriegens (青)、E. coli (赤)、および S. aureus (緑) コロニーの時間の関数としてのコロニー ピーク活性曲線。

図３および図４に記載された曲線に従って、コロニーの中心からの距離に対応する点を取得する。 図６および図７に示すように、各「リング」の空間座標（ｘ、ｙ）が得られる。 信号の平滑化された包絡線関数が空間内の各点に配置されます (図 5)。 したがって、多くのシグナルは、それぞれの特定の半径 (コロニーの中心から最大活動点までの距離) に対応します。 理想的な状況では、同じ「リング」内 (コロニー中心から同じ距離にある) のすべてのシグナルが同じになります。 ただし、細菌コロニーの成長は上記のさまざまな条件の影響を受けるため、これらのシグナルは若干異なります。 したがって、各半径がそれを特徴付ける 1 つの信号を受信できるように、特定の半径のすべての信号の平均化を行う必要があります。 このような平均化は、切り捨て平均法 1​​6 を採用して実行されました。切り捨ては振幅ではなく、アクティビティのピークの時間で実行されました。

ここで、L は特定の距離にある包絡線信号の数、\({k}_{b}\) および \({k}_{f}\) は各側から切り詰められた包絡線信号の数です。 つまり、指定された半径内のアクティビティのピークが一般的な傾向 (時期尚早または遅延) と大きく異なる信号は考慮されませんでした。 得られた平均信号は、中心からの距離と時間の関数としてマッピングされました (図 8、上の画像)。

黄色ブドウ球菌のコロニー中心からの距離と時間の関数としての平均シグナルのエンベロープ（上）と、コロニーの中心からの距離の関数としての活動のピーク（下）。 シグナルの同様の時空間的挙動は、大腸菌およびナトリジェンス菌のコロニー内でも観察されました。

マップ上でいくつかの時点を選択することにより、コロニーの中心からの距離に応じて活動のピークがどのように見えるかを観察することができます。 ピークの幅はアクティビティの「リング」の幅に比例し、その時間変化を図8の下のグラフに示します。

さまざまな時間における信号の空間幅を図 8 に示します。信号幅は、ピーク値から特定の値までの減少に対応します。 ノイズ、不要な信号、またはその他の要因が存在しない場合、基準は単純になります。つまり、信号レベルまたはその電力を最大値からゼロに下げるということになります。 ただし、実際の状況では、信号がノイズと区別できる場合には、何らかのしきい値が存在する必要があります。 信号パワーの最大値から最大値の 1/3 までの減少が基準として選択されました。 つまり、実際の幅は受け取った幅よりわずかに大きいことに注意してください。 瞬間ごとの幅を求めることが可能です。 この幅は、対応する時点の「リング」の幅と一致します (図 9 を参照)。

黄色ブドウ球菌のコロニーの活性「リング」の幅の決定: (a) シグナル値と活性リングの決定された幅 (紫線)、(b) 得られた活性「リング」の幅、(c) ) 異なる時間における 1 つのコロニーについて得られた活性「リング」(黒線) の幅の比較。 シグナルの同様の時空間的挙動は、大腸菌およびナトリジェンス菌のコロニー内でも観察されました。

図9a、bから、リング幅の変化は小さいものの、多少の偏差はあるものの一定であると見なすことができることがわかります。 つまり、「年輪」の観測が開始されてから、「年輪」が消滅する観測終了まで、「年輪」の幅はほぼ変化しませんでした（計測精度には多少の留保はありますが）。 、多数の微生物のコロニーの動作におけるランダムな現象、ノイズなど）。 選択された 1 つのコロニーについて説明された動作は、この研究で考慮されたすべての種類の細菌について観察されました。 「リング」の幅は細菌の種類ごとに異なります。 図 10 は、すべての種類の細菌コロニーの「リング」の幅を示しています。 得られた結果は、John Pirt によって導入された微生物コロニー増殖の数学的モデル (「Pirt モデル」) に対応します5。

さまざまな細菌コロニーの時間の関数としての活動「リング」の幅。 (a) スペックル法によって決定されるアクティビティ「リング」の幅。 (b) Pirt モデル (式 9) を使用して計算された「リング」幅。 パラメータ: モデルの alpha と r もスペックル実験から取得されます。 各曲線は、特定の種類の細菌の 1 つのコロニーの活動「リング」の幅を経時的に示しています。

Pirt 研究 5 では、アクティブ ゾーンまたは「リング」の幅を計算するための式が提供されています。

ここで、ω はコロニーの活性細胞増殖ゾーンの幅、r は時間 t におけるコロニーの半径、\({r}_{0}\) は t = 0 における半径です。 α は、(μ, h−1) としても知られる比成長率であり、ゴンペルツ方程式から求めることができます 8,17。 したがって、実験データ (コロニー成長の半径、対応する時間、μ) があれば、式 1 を使用して活性ゾーンの幅または「リング」の幅を計算することができます。 (9)。 この研究で得られた結果と Pirt モデルを比較したものが図 10 です。

リング幅の全体的なパターンは細菌種ごとに独特であり、均一です。 ただし、微生物種の各コロニーの活動年輪幅のダイナミクスは、時間の経過とともにシフトする可能性があります。 コロニーの成長が長くなると、コロニーの増殖、つまり斑点の活性がより長くその活性を維持します。 これはプレート上のコロニーの分布に関係していると考えられます。 寒天プレート上の細菌コロニーはランダムに分布しているため、その増殖は隣接する微生物コロニーの影響を受けました。 微生物コロニーの成長は、近接する隣接コロニーの影響を強く受けるため、特定のコロニーに隣接するコロニーが多ければ多いほど、培地の共通の栄養資源の枯渇により、その成長が早く停止します 18,19。

Pirt モデルは、微生物コロニーの活発に成長している端の幅は、スペックル活動によって測定されるのと同様の幅である可能性があると予測します (図 10. V. natriegens a と b を比較)。一方、微生物コロニーの活性端の幅は過大評価されています。大腸菌および黄色ブドウ球菌の場合の微生物コロニー。 この違いは、Pirt 方程式の成長速度 α, h−1 が定数であるのに対し、実際にはコロニーの成長中に変化 (減少) するという事実から生じていることが暗示される可能性があります 4。 考慮すべきもう 1 つの側面は、どちらの場合も計算に実験データが使用されたことです。 ただし、前述したように、ノイズは測定精度に影響を与えます。

寒天培地上での微生物コロニーの増殖は、環境サンプル、食品サンプル、または医療サンプルの微生物汚染を分析するための研究および日常的なテストにおいて微生物学で使用される技術です。 微生物コロニーの成長を説明するには、多くの数学的モデルが使用されます4、5、18、20。 最外側の活動ゾーン (コロニーの「リング」) の幅は、コロニーの成長ダイナミクスの計算を簡素化 (線形化) するために数学モデルに含まれることがよくあります 5,21。 しかし、成長するコロニーの活動領域の実際のサイズに関する実験データは不足しています。

微生物コロニー増殖の Pirt モデルは、時間の経過に伴う微生物コロニーの放射状増殖を説明した最初のモデルの 1 つです。 隣接するコロニーによる成長阻害がなく、エッジ上の活動ゾーンのサイズが一定であれば、モデルは実際の観察とよく一致します。 Pirt モデルは、多くの細胞から発生する遠く離れた成長するマクロコロニーで検証されています5。 しかし、環境サンプルや医療サンプルの日常的な検査では、通常、隣接するコロニーに対してランダムな距離で増殖する微小コロニーが観察されます22。 さらに、微生物種のゲノムまたは生理学的構成により、そのコロニーはさまざまな 3D 形状 (ドーム型、平面など) で成長し、それがコロニーの端の活動ゾーンの幅に影響を与える可能性があります 23 。

Warren et al.24 によって提案された最近のモデルの 1 つでは、微生物細胞の向き (水平または垂直) とコロニー周囲の段階的な栄養素の枯渇がコロニーの成長のダイナミクスを定義します。 Warren らは、シミュレーションの中で、コロニーの周囲に代謝的に活性な「リング」構造が形成されていることに気づきました。この構造は、基質と直接接触している細胞によって形成され、最も増殖活動が行われる場所です 24。

この（私たちの）研究では、レーザースペックル画像のサブピクセル相関分析アルゴリズムとともに微生物コロニーの成長を記録するレーザースペックルベースのシステムが開発されました。これにより、コロニー内の活動ゾーンの識別と定量化が可能になります。 スペックル信号はコロニーの成長速度と良好な相関関係があり、コロニーあたりの細胞数に依存します (図 3 および 4 を参照)。

スペックル イメージングによって記録されたパラメーター (活動リングの幅、中心からの最大移動距離、微生物コロニーの成長曲線) の特定のばらつきが観察されます。これは、寒天培地の特性の変化、サンプルの生物学的変動、および/に起因する可能性があります。または測定の精度。

寒天プレートは微生物の培養中に水分を失う（乾燥する）傾向があることが知られています25。 スペックル信号の形成と強度は、寒天培地の乾燥によって影響を受ける可能性があります。 私たちの観察によると、多くの実験では最初の 3 ～ 5 時間で、寒天培地の乾燥に伴う影響が発生する可能性があります。 ただし、 (1) この効果はシャーレ全体に「波」のように広がり、追加の効果を引き起こすことなく消滅しました。 (2) 観察された「乾燥」の影響は、「リング」の形成よりもはるかに早く発生しました。 したがって、たとえ乾燥が生じても、その影響はリングの形成に影響を及ぼさない。 乾燥効果の例を図 11 に示します。 培養終了時よりも培養開始時（0～4時間）のほうが大きな体重減少が観察されました。

ペトリ皿内で乾燥させた寒天 (細菌を含まない寒天培地) のスペックル イメージング。

接種後、寒天培地上でのコロニーの増殖は同様でした。コロニーの初期増殖速度は同じである傾向がありますが (図 3 を参照)、その後それらの増殖は互いに分岐し、異なる時間でコロニーの増殖が停止しました。 プレート上のコロニーの割り当てはランダムであり、隣接するコロニーの数が変化するため、リソースの枯渇と、その後の各コロニーの成長停止が異なるタイミングで発生する可能性があります。 それにもかかわらず、各コロニーは、中心から離れる特徴的な移動と、活発な増殖が減少する時間の経過による停止を伴う活性リングを示しました（図12を参照）。

ビブリオ・ナトリジェンスの老化したコロニーでは、活動リングシグナルは時間の経過とともに停止します。 上: コロニースペックル画像、下: サブピクセル相関アルゴリズムを適用した後の画像、活動リングの停止。

コロニーが活動を停止しても、生のスペックル画像ではまだ見えますが (図 12 (上))、リング効果は示されなくなります (図 12 (下))。 したがって、「リング」は寒天の乾燥に関連するランダムな現象でも、コロニーの端のアーチファクトでもなく、微生物の活動のシグナルであり、コロニーの成長が停止すると消えると結論付けられます。

提案されたスペックル技術により、ミクロおよびマクロコロニーの成長全体にわたる活動ゾーンの幅の動態を特定し、記録することができます。 将来的には、レーザースペックルを使用したコロニーの成長記録は、サブコロニーの解像度で成長のダイナミクスと増殖活動を定量化するための魅力的な非侵襲的なツールになる可能性があります。

スペックル イメージング法では、白色光下での標準的なイメージング シリーズよりもコロニー内の微生物の活動についてより多くの洞察が得られます。

レーザースペックルイメージング技術は真に非侵襲的な方法であり、微生物コロニーの増殖を中断なく監視できることが実証されています（スペックルシステムでのコロニーの増殖速度は、基準条件での微生物の増殖と統計的に区別できませんでした）。 サブピクセル相関アルゴリズム（「スペックル画像を時間信号に変換するアルゴリズム」）を適用した後、スペックル信号の最大出現時間はコロニー内の細胞数に比例しました（図4）。

高感度相関サブピクセル分析により、コロニー内には、コロニーの成長中に中心から端に移動する明確な活動ゾーンが存在することが明らかになりました。 我々は、3 つの異なる微生物種のコロニーにおいて、同様のパターンの活動ゾーン (「リング」) 移動を観察しました。 さらに、活発に成長しているすべてのコロニーにリングの存在が観察されました（補足図S1を参照）。 「リング」の移動速度は微生物種ごとに異なり、したがってこれらの種ごとに典型的な異なる増殖速度を反映していました。

スペックル イメージングは​​、微生物コロニー内の活動ゾーンの視覚化に初めて貢献した、有望で強力な技術です。 以前は、これらのゾーンの存在は数学的に予測されていました。 現在の研究では、微生物コロニー研究のためのスペックルイメージング技術をさらに開発するための潜在的な方法、つまりスペックル検出のための光学および電子システムの感度を高めること、ノイズを最小限に抑えること、技術を多重化するためのオプションを模索することも示唆されています。 これにより、微生物の増殖活動を可能な限り早期に記録できるだけでなく、ゆっくりと成長するコロニーを検出し、コロニー内の微生物の活動を特定できるため、提案された技術は研究開発、医学、疫学における多くの直接応用に適したものになります。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

Levin-Reisman, I.、Fridman, O.、Balaban, NQ ScanLag: コロニーの成長と遅延時間のハイスループット定量化。 J.Vis. 経験値 89、e51456 (2014)。

Google スカラー

竹内 良 ほかコロニーライブ - 微生物コロニーの増殖動態を測定するハイスループットな方法 - 大腸菌における遺伝子ノックアウトの多様な増殖効果を明らかにします。 BMC微生物。 14、171 (2014)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

MH ツヴィエタリング、I ヨンゲンブルガー、FM ロンバウツ、K ヴァント リート。 細菌の増殖曲線のモデリング。 応用環境。 微生物。 56(6)、1875–1881 (1990)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rivas、EM et al. 領域の成長と酵母コロニー内の総細胞数と生存細胞数を記述する単純な数学モデル。 レット。 応用微生物。 59(6)、594–603 (2014)。

論文 PubMed Google Scholar

Pirt, SJ 細菌および真菌の表面コロニーの増殖様式の動力学的研究。 J. Gen. Microbiol. 47(2)、181–197 (1967)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Váchová, L.、Cáp, M. & Palková, Z. 酵母コロニー: 老化、環境適応、寿命の研究のモデル。 オキシド。 医学。 細胞。 ロンゲブ。 2012、601836 (2012)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

グッドマン、JW 光学におけるスペックル現象。 理論と応用 (イングルウッド、2007)。

Balmages, I. et al. 微生物コロニー形成単位の早期検出のためのレーザースペックルイメージング。 バイオメッド。 オプション。 エクスプレス 12(3)、1609 ～ 1620 (2021)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Pieczywek、P. et al. 光学センサーを使用した、保存されたリンゴ果実の真菌感染の早期検出 - バイオスペックル、ハイパースペクトル イメージング、およびクロロフィル蛍光の比較。 食品管理 85、327–338 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

Cutolo、M. et al. レーザースペックルコントラスト分析 (LASCA) は、全身性硬化症のブロックにおける新参者ですか? 強皮症患者の末梢血灌流を測定するための LASCA の信頼性を評価するための体系的な文献レビューとパイロット研究。 自己免疫。 改訂 17(8)、775–780 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

Weinstock, MT、Hesek, ED、Wilson, CM & Gibson, DG 分子生物学の宿主として急速に成長しているビブリオ・ナトリジェンス。 ナット。 方法 13(10)、849–851 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Balmages, I.、Bliznuks, D.、Liepins, J.、Zolins, S. & Lihachev, A. 細菌活動検出のためのレーザースペックル時系列相関分析。 手順 SPIE 11359、113591D (2020)。

Google スカラー

Gåsvik、KJ 光学計測学第 3 版 （ワイリー、2002）。

Google Scholar を予約する

Lai, X. & Torp, H. 血流速度測定のための相互相関法を使用した時間遅延推定のための補間法。 IEEEトランス。 ウルトラゾン。 強誘電体。 周波数コントロール 46(2)、277–290 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Tukey、JW データを平滑化するための非線形 (重ね合わせ不可) メソッド。 手順コン。 記録イースコン。 673 (1974)。

リーマン、EL 点推定理論 (Wiley、1983)。

MATH を予約する Google Scholar

Balmages, I. et al. レーザースペックルイメージングによる微生物コロニーの成長パラメーターの評価。 手順 SPIE 12144、121440B (2022)。

Google スカラー

Chacón, JM、Möbius, W. & Harcombe, WR コロニーサイズの変動の空間的および代謝的基礎。 ISME J. 12(3)、669–680 (2018)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Cooper, AL、Dean, AC & Hinshelwood, C. 寒天プレート上の細菌コロニーの増殖に影響を与える要因。 手順 R. Soc. ロンド。 B.バイオル。 科学。 171(1023)、175–199 (1968)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Kreft, JU、Booth, G.、Wimpenny, J. BacSim は、細菌コロニーの増殖を個別にモデリングするためのシミュレーターです。 微生物学 (読書)。 144(Pt 12)、3275–3287 (1998)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

パニコフ、NS 不均一な微生物の増殖。 微生物増殖速度論、238–251 (Chapman & Hall、1995)。

Jeanson, S.、Floury, J.、Gagnaire, V.、Lortal, S. & Thierry, A. 固体培地および食品中の細菌コロニー: それらの増殖と微小環境との相互作用に関する概説。 フロント。 微生物。 6、1284 (2015)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

ウィンペニー、JW 細菌コロニーの成長と形態。 J. Gen. Microbiol. 114(2)、483–486 (1979)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ウォーレン、MR 他硬寒天上で増殖する高密度の細菌コロニーの時空間的確立。 Elife 8、e41093 (2019)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Sandle, T. 一方向の気流下でのプレートへの曝露と微生物の増殖に対する重量減少の影響。 ユーロ。 J. パレンター。 薬局。 科学。 20(2)、45–50 (2015)。

Google スカラー

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この研究は、ERDF プロジェクト「微生物増殖分析のための高速かつコスト効率の高い機械学習ベースのシステム」(契約 No.1.1.1.1/19/A/147) によって資金提供されています。

リガ工科大学コンピュータサイエンス情報技術学部コンピュータ制御およびコンピュータネットワーク学科、ズンダクラスマラ10、LV-1048、リガ、ラトビア

イリヤ・バルマジェス & ドミトリース・ブリズヌク

Laboratorija Auctoritas Ltd、Čiekurkalna 1. linija 11、リガ、LV-1026、ラトビア

イリヤ・バルマゲス、アーネスト・トーマス・オージンス、エドガース・バラノヴィッチ

ラトビア大学微生物学・バイオテクノロジー研究所、Jelgavas str. 1、リガ、LV-1004、ラトビア

ジャニス・リーピンズ & アーネスト・トーマス・オージンス

ラトビア大学原子物理分光研究所、Jelgavas str. 3、リガ、LV-1004、ラトビア

イルゼ・リハコバ & アレクセイ・リハチョフ

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イリヤ・バルマージュへの通信。

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転載と許可

Balmages, I.、Liepins, J.、Auzins, ET 他。 微生物コロニーの成長メカニズムを解明するためのスペックル イメージングのサブピクセル相関解析の使用。 Sci Rep 13、2613 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-29809-0

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受信日: 2022 年 8 月 29 日

受理日: 2023 年 2 月 10 日

公開日: 2023 年 2 月 14 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29809-0

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